Development Of Fast And Economic Qpcr-based Method For Meat Species Detection

Thesis (M.Sc.) -- İstanbul Technical University, Institute of Science and Technology, 2013Et, içerdiği amino asitler, vitaminler, yağ ve özellikle hayvansal protein ile insan sağlığı için vazgeçilmez bir besin kaynağıdır. Türkiye İstatistik Kurumu’nun (TUIK) 2012 verilerine göre; Türkiye’de yıllık kişi başına tüketilen et miktarı 12 kg’dır. Yine TUIK’in sonuçlarına göre, Avrupa ülkelerinde kişi başına tüketilen et miktarı 30 kg iken Amerika Birleşik Devletlerinde bu sayı 60 kg’a kadar çıkmaktadır. Bu veriler, Türkiye’de et tüketiminin son derece az olduğunu göstermektedir.Artan insan popülasyonu ve et ürünlerinin maliyetlerinin yüksek olması et tüketim oranını her yıl azaltmaktadır. Bu yüzden et üreticileri, fiyatları düşürmek için farklı et türlerini (at, esek, domuz, hindi, ve tavuk) karıştırmaya başlamıştır. Benzer pigmentasyona sahip et türleri (dana ve at, tavuk ve domuz gibi) dondurulduktan sonra veya işlenmiş et ürünlerinde kullanıldıklarında tüketici tarafından algılanması neredeyse imkansız hale gelir. Bu nedenle, köfte, salam, sosis, sucuk gibi ürünlerde sahteciliklerin yapılması oldukça kolaydır. 2013 yılından önceki Türk Gıda Kodeksi’ne göre, et üreticilerinin karıştırdığı hayvan türlerini, ürünlerin etiketlerinde bildirmesi koşuluyla karma et uygulamasına izin verilmekteydi. Ancak, Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı yaptığı çalışmalar sonucunda, piyasada bulunan bir çok ürünün etiketinde, içerdiği hayvan türünün belirtilmediğini tespit etmiştir. Bu durum, 2013 yılında revize edilen Türk Gıda Kodeksi’nde karma et uygulamasının tamamen yasaklanmasına neden olmuştur. Et tür tayini analizlerinde en sık kullanılan yöntemler, protein ve nükleik asit tabanlıdır. Fakat, ısıl işleme maruz kalan ürünlerin protein yapıları bozulduğundan, protein tabanlı yöntemlerin et tür tayini için yetersiz kaldığı bildirilmiştir. DNA tabanlı yöntemlerin, protein tabanlı yöntemlere göre daha avantajlı olduğu düşünülmektedir. DNA molekülü sıcaklığa dayanıklı bir moleküldür, tüm hücrelerde aynı özelligi gösterir ve ayrıca tür hakkında daha fazla bilgi sağlar. Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) tabanlı metotlar, belli bir hayvan türüne ait özgü DNA sekansını çoğaltma gücüne sahiptir. Diğer taraftan, konvensiyonel PZR ile kantitatif sonuçlar elde edilemez ve jel elektroforezi gibi PZR sonrası adımlar gerektirdiği için zaman alıcı bir yöntemdir. Kantitatif eş zamanlı PZR (quantitative Real Time PCR- qPCR), hem kalitatif hem de kantitatif sonuçlar sağlar. Bu teknikte, hedef genin çoğalması, floresans işaretleyiciler kullanılarak eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Et tür tayini çalışmalarında, Sybr Green ve oligonükleotit problar en çok kullanılan işaretleyicilerdir. Sybr Green belli bir konsantrasyonun üstünde kullanıldığında PZR reaksiyonunu inhibe edebilir ve ayrıca çoklu hedefleri tespit etmek için uygun değildir. Bu yüzden, yüksek maliyetli olmalarına rağmen oligonükleotit problar en çok tercih edilen işaretleyicilerdir. Alternatif olarak, Yüksek Çözünürlükte Erime xxiv (HRM) boyaları, erime eğrisi analizlerinde, DNA denatürasyonu ile birlikte çok daha ayırt edilebilir sinyal değişimlerine neden oldukları için tercih edilmektedirler. HRM boyaları sadece çift zincirli DNAya bağlanır, bu da boya molekülünü erime sırasında tek zincirli DNAya yeniden bağlanmasını önler ve üstün erime eğrisi çözünürlüğü sağlar. SYBR Green boyalarının aksine, HRM boyaları yüksek konsantrasyonlarda kullanılabilir, çünkü HRM boyaları DNA polimerazı ve PZR reaksiyonunu inhibe etmezler. Ayrıca HRM boyaları Sybr Green ile karşılaştırıldığında hidrojen bağlarına 4 kat daha fazla bağlanır. Bu tezin amacı; et ürünlerinin içerisine karıştırılan farklı et türlerinin (sığır, tavuk, hindi,at, eşek ve domuz) kalitatif olarak varlığını hızlı, güvenilir ve ekonomik bir biçimde tespit edilebilmesi için qPCR tabanlı bir sistem geliştirmektir. Bu çalışmada ilk olarak, 20 dakikadan az bir sürede tamamlanabilen, enzim içermeyen bir DNA izolasyon metodolojisi geliştirilmiştir. Geliştirilen metodoloji, boncuk ile parçalama ve silika kolon yöntemine dayalıdır. Bu metodolojide, hekzadesiltrimetilamonyum bromür (CTAB), guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması kullanılmıştır. Guanidin tiyosiyanat ve boncuk ile parçalama uygulaması hücreleri parçalamak için kullanılmıştır. Ayrıca guanidin tiyosiyanat DNA bağlanmasında ve PZR inhibitorlerinin uzaklaştırmasında rol oynar. DNA izolasyon sonuçlarına göre, geliştirilen DNA izolasyon metodolojisi kullanılarak elde edilen DNAların saflıkları ve konsantrasyonları ulaşılmak istenen aralıklarda elde edilmiştir: sırasıyla 1.6-2 ve 50-1000 ng/μl. Elde edilen DNAların kalitesi, qPCR’da bu DNAların 200 nanogramının kalıp DNA olarak kullanılmasıyla sınanmıştır. Elde edilen eşik döngü sayılarının 20’nin altında elde edilmesi, elde edilen DNAların PZR çoğalması için uygun olduğunu kanıtlamıştır. Piyasada mevcut ticari DNA izolasyon kitleri, zaman alıcı reaksiyonlara dayalıdır ve DNA izolasyon işlemi en az 1.5 saat sürmektedir. Bu çalışmada, enzimatik adımlar içermeyen bir DNA izolasyon protokolü geliştirilmiştir. DNA izolatları, sadece fiziksel ve kimyasal hücre parçalamasıyla elde edilmiştir. Bu da, toplam analiz süresinin (20 dakikadan az) ve DNA izolasyonun maliyetini önemli ölçüde azaltmıştır. Bu zamana kadar yapılan çalışmalarda, genellikle 12S rRNA, sitokrom b geni ve 16S rRNA gibi evrensel mitokondriyal genler, et türüne özgü prop dizaynı için hedef olarak seçilmişlerdir. Bu durum, özgüllük problemlerine neden olabilmektedir. Mitokondriyal genler son derece korunmuş genlerdir, bu yüzden at ve eşek gibi aynı cinse ait türler arasında ayrım yapmak zordur. Daha özgül sonuçlar elde etmek için, bu çalışmada her bir hayvan türü için yüksek derecede değişken gen bölgelerin çoğaltılmasına odaklanılmıştır. Bu yaklaşım sayesinde, özgül olmayan çoğalmalar önlenmiş ve validasyon çalışmaları için iş akışı kolaylaştırılmıştır. Bu çalışmada geliştirilen qPCR metodolojisi, tekli ve çoklu DNA tiplerini hedef alacak şekilde dizayn edilmiştir. Bu metodoloji sayesinde, tek bir HRM boyası (EvaGreen) kullanılarak, farklı PZR ürünlerinin, erime sıcaklığı (Tm) farklılıklarına göre çoklu tespit yapılmıştır. Referans et örneklerinin qPCR sonuçlarına göre; hedefe özgü erime sıcaklıkları at için 82.02 ± 0.29˚C, domuz için 84.3˚C ± 0.32˚C, eşek için 78.80 ± 0.38˚C, hindi için 84.86 ± 0.29˚C, tavuk için 81.91 ± 0.34˚C ve sığır için 86.96 ± 0.31˚C olarak belirlenmiştir. Hindi/sığır, tavuk/sığır, tavuk/hindi, domuz/eşek, eşek/at, domuz/at ikili karışımlarının qPCR denemelerinde ve hindi/tavuk/sığır, domuz/eşek/at üçlü qPCR denemelerinde, istenilen hedeflere özgü olan birden fazla erime sıcaklığı tespit edilmiştir. xxv Tespit limitini (Limit of Detection –LOD) belirlemek için; 10 gramlık et karışımları hazırlanmıştır. Sırasıyla hedeflenenler hayvan eti, sığır eti ile karıştırılmıştır. Sığır etiyle karıştırılan her hayvan türü , karışımda 1 – 100 kopya gen sayısı bulunduracak şekilde karışımlar yapılmıştır. Sığır etinin 1 gramında tespit limiti; tavuk için 4 gen kopya sayısı; hindi için 3 gen kopya sayısı; at , eşek ve domuz için ise 1 kopya gen sayısı olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, standart et karışımları akredite referans laboratuvarlar tarafından hazırlanmadığı için, gerçek LOD’nin kabaca tahmini yapabilmek için bu çalışmalar yürütülmüştür. Türkiye gıda piyasasına sunulması planlanan çiğ ve işlenmiş et ürünleri geliştirilen yöntemle başarıyla analiz edilmiştir. Numuneler akredite gıda kontrol laboratuvarları tarafından sağlanmıştır. Analiz edilen numune tipleri köfte, döner, sucuk, salam ve sosis gibi işlenmiş ürünler ve bir et üretim tesisinin üretim tezgahlarından alınan sürüntü numuneleridir. Analiz edilen toplam 83 örnekten; 24 tanesinin tavuk eti, 9 tanesinin hindi eti ve 1 tanesin domuz eti içerdiği tespit edilmiştir. Sonuçların doğruluğu, DNA sekanslama yöntemi kullanılarak onaylanmıştır. Geliştirilmiş olan bu yöntemin, mevcut PZR tabanlı yöntemlere göre en az iki kat daha hızlı olduğu ve 75 dakika içinde hassas sonuçlar verebildiği kanıtlanmıştır. Et türü tayini için kullanılan mevcut qPCR tabanlı yöntemler yüksek zaman ve maliyet gerektirmektedir. Bunun temel nedeni DNA ekstraksiyonu ve qPCR adımlarındaki uzun inkübasyon süreleri ve yüksek sarf maliyetleridir. Bu çalışmada bu sorunlara çözüm getirmek için yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu sistemin başarısının altında enzim içermeyen DNA protokolü ve tek HRM boyası ile yapılan çoklu hedef tespiti yatmaktadır. Bu çalışmada ilk defa, farklı hayvan türlerinden çoğaltılmış üç farklı hedef DNA qPCR’da tek bir boya kullanılarak, Tm’lerindeki farktan faydalanılarak ayırt ve tespit edilebilmiştir. Elde edilen sonuçlar geliştirilen yöntemin 75 dakikadan kısa bir sürede hassas sonuçlar verebileceğini göstermiştir. Böylelikle mevcut PCR tabanlı et türü tayin yöntemlerine nazaran en az 2 kat daha hızlı sonuç elde edilebilmiştir. Bu çalışmada geliştirilen qPCR’a dayalı metodoloji, ısıl işlem görmüş et karışımlarında at, eşek, domuz, tavuk ve hindi etlerinin hızlı ve rutin tespitleri için potansiyel bir moleküler araç olarak kullanılabilir. Türe özgü primerlerin kullanılması, bu metodu çiğ ve işlenmiş etlerin tespitinde son derece hassas kılmaktadır. Diğer taraftan, geliştirilen bu metodolojinin, akredite gıda kontrol labaratuvarları tarafından hazırlanan referans örnekler kullanılarak validasyonu yapılmalıdır.Meat contains amino acids, vitamins, fat and especially animal proteins, which are extremely important for human health. According to data from Turkish Statistical Institute (TUIK) meat consumption per capita in Turkey was 12 kg in 2012. The meat consumption per capita in United States of America (U.S.A.) and European Union (EU) are approximately 60 kg and 30 kg, respectively. These data show that; meat consumption in Turkey is lower than EU and U.S.A. Increasing human population and the cost of meat products have resulted in gradual decreases in meat consumption over the years. So that, the manufacturers started to mix different meat types (horse, donkey, pig, turkey and chicken) to reduce the costs. If the food is frozen and processed, it becomes impossible for consumer to differentiate the meat type which has similar pigmentation (beef- horse, chicken-pork, etc.). Therefore, forgery is commonly encountered within the production of meatball, sausage and salami. According to the Turkish Food Regulations before 2013, mixed meat application is permitted as long as the producers state the mixed meat types on the label. On the other hand, the Ministry of Food, Agriculture and Livestock has determined undeclared mixed meat applications in the Turkish Food Market. This has led to the new regulations in 2013, which strictly prohibited the mixed meat application. Protein and nucleic acid-based methods have been commonly used for meat species identification. The protein-based methods have been reported to be inadequate for the meat species identification since the protein structures deformed in thermally processed foods. DNA based methods have been considered to be more advantageous than the protein based methods. DNA is thermo-stable, shows the same features in all cells and provides more information about the species. Polymerase chain reaction (PCR) based methods have a power of amplifying a specific DNA molecule that belongs to a certain animal species. On the other hand, the conventional PCR cannot provide quantitative results and the post PCR steps such as gel electrophoresis make it time consuming. Quantitative Real Time PCR (qPCR) can provide both qualitative and quantitative results for meat type identification. In this technique, amplification of the target gene can be monitored online by the use of fluorescent reporters. The most commonly used reporters in meat type detection are Sybr Green dye and the oligonucleotide probes. Sybr Green can inhibit PCR reactions if used above a certain concentration and it cannot be used for detection of the multiple targets. This is why the oligonucleotide probes are the most frequently used reporters despite of their high costs. As an alternative, High Resolution Melting (HRM) dyes are preferred for use xx with melting curve assays due to the more discrete signal change occurring upon DNA denaturation. HRM dyes only bind to double stranded DNA that prevents the dye molecule from redistribution during melting and provides superior melt curve resolution. Unlike SYBR Green dye, HRM dyes can be used at high concentrations because they do not inhibit DNA polymerases and PCR reaction. HRM dyes great ability to bind the hydrogen bond almost 4 times more than SYBR Green. The aim of this study, develop a quick, reliable and low-cost qPCR based methodology to qualitatively detect different meat species (cattle, chicken, turkey, horse, donkey and pig) in food products. Firstly in this study, an enzyme free DNA extraction methodology which can be completed in less than 20 minutes was developed. The developed methodology was based on bead beating treatment and silica column method. In this methodology, hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), Guanidinium thiocyanate and bead beating were used to disrupt the cells. Guanidinium thiocyanate also acted in PCR inhibitor removal and DNA binding. The results showed that the purities and concentrations of the DNA extracts obtained using the developed DNA extraction methodology were in the desirable ranges: 1.6-2 and 50-1000 ng/μl, respectively. The obtained DNA qualities were also assessed by using 200 ng of the template DNAs in qPCR. The obtained threshold cycle numbers were less than 20, which implied that the obtained DNAs were suitable for PCR amplification. The current commercially available DNA extraction kits are based on time-consuming reactions that are completed in at least 1.5 hours. In this study, we have developed a DNA extraction protocol, which does not include enzymatic steps. The DNA extracts were obtained via only the physical and the chemical cell disruption. This has significantly decreased the total time (less than 20 minutes) and the cost of the DNA extraction. Universal mitochondrial DNA sequences such as; 12S rRNA, cytochrome b and 16S rRNA genes have generally been chosen as the target for meat type specific probe design. This has led to specifity problems in the detections. Mitochondrial genes are highly conserved so that differentiation is difficult between the species that belongs to the same genus such as; horse and donkey. To obtain more specific results, we concentrated on the amplification of highly variable gene regions for the each animal type. This approach prevented the non-specific amplifications and led to easier workflow for the validation studies. The qPCR methodology was designed to target both single and multiple DNA types. The multiple detection was based on melting temperature (Tm) differences of the different PCR amplification products with a single HRM dye (EvaGreen). The qPCR trials on the reference meat samples showed that the target specific melting peaks can be obtained at 82.02 ± 0.29˚C for horse, 84.3˚C ± 0.32˚C for pig, 78.80 ± 0.38˚C for donkey, 84.86 ± 0.29˚C for turkey, 81.91 ± 0.34˚C for chicken and 86.96 ± 0.31˚C for cattle. Q-PCR trials on the binary mixtures of turkey/cattle, chicken/cattle, turkey/chicken, pig/donkey, donkey/horse and horse/pig and triple mixtures of turkey/chicken/cattle and pig/donkey/horse resulted in multiple melting peaks that are specific to the intended targets. To obtain the limit of detection (LOD), 10 g standard meat mixtures that contain 1-100 copies of the additive meat type DNA were prepared. The LODs were 4 chicken copies/gr cattle sample, 3 turkey gene copies/gr cattle sample, 1 horse gene copy/gr cattle sample, 1 donkey gene copy/gr cattle sample and 1 pig gene copy/gr cattle sample. xxi On the other hand, since the standard meat mixtures were not obtained from an acredited reference laboratory, the detected LODs were rough estimations of the real LODs. Commercial samples which are intended to be introduced to the Turkish food market were screened. The commercial samples were obtained from acredited food laboratories. The sample types were sucuk, doner kebap, beef sausage, beef salami and the swab samples from meat production benches. 24 chicken, 9 turkey and 1 pig meat positive samples were detected among the 83 screened samples. The results were also confirmed via the DNA sequencing of PCR products. The currently available qPCR based meat type identification methodologies are time and money consuming. The main reasons behind these are the long incubation times and high costs of the available DNA extraction and the multiplex qPCR methodologies. In this study, a new system was developed to overcome these problems. This was achieved via an enzyme free DNA extraction methodology and a multiplex qPCR using a single HRM dye. For the first time, this study introduced discrimination of three different qPCR amplicons from various animal specific gene products based on the differences in Tms. The overall results proved that the developed method could give sensitive results in less than 75 minutes, which is at least two times faster than the currently available PCR-based methods for meat type detection. The qPCR based methodology developed in this study is a potential molecular tool that can be used in rapid and routine detection of horse, donkey, pig, chicken and turkey meats present in heat treated meat mixtures. The use of species-specific primers makes the method very sensitive for determination in raw and processed meats. On the other hand, the methodology must be validated using the reference samples prepared by reference accredited food control laboratories.Yüksek LisansM.Sc