Tuberculose bovina: detecção molecular e genotipagem de Mycobacterium bovis

Nesta dissertação, pretendeu-se avaliar e aplicar um conjunto de ferramentas moleculares a estirpes de Mycobacterium bovis e Mycobacterium caprae, com o objectivo de melhorar o diagnóstico da tuberculose bovina e de proceder à primeira genotipagem destas estirpes em Portugal, clarificando vias de transmissão e a eventual existência de reservatórios silvestres. A extracção de DNA por disrupção mecânica/ lise enzimática e o PCR-REA gyrB produziram resultados que permitiram aumentar a sensibilidade e especificidade do diagnóstico, e identificar um conjunto aleatório de isolados (N=293), de várias regiões do país, com vista à sua genotipagem. O spoligotyping permitiu atestar da elevada diversidade dos padrões Portugueses (Hunter-Gaston Index; h=0,9) e compará-los com outros países. A análise dos polimorfismos dos MIRU-VNTR permitiu alcançar uma superior discriminação (h=0,98), especialmente nos “spoligotypes” mais frequentes, permitindo comprovar, em consonância com dados das explorações, a transmissão entre efectivos bovinos e entre bovinos e espécies cinegéticas da mesma área. Pelos seus índices discriminatórios elevados, as duas técnicas de genotipagem demonstraram a sua utilidade futura para estudos de epidemiologia molecular, integrando estratégias mais eficazes de erradicação em Portugal. ### Summary - The evaluation of several molecular tools for Mycobacterium bovis and Mycobacterium caprae was undertaken in this thesis, aiming to improve bovina tuberculosis diagnosis, and to produce the first genotyping results of Portuguese strains, in order to clarify transmission routes and the possible existence of wildlife reservoirs. Results obtained by DNA extraction, with a combined mechanical disruption/ enzymatic Iysis, and PCR-REA gyrB analysis were proven to increase diagnosis sensitivity and specificity, and were applied to the identification of a random set of isolates (N=293), from several geographical regions, that were latter genotyped. Spoligotyping revealed the high diversity of Portuguese patterns (Hunter-Gaston lndex; h=0.9), and we were, able to compare them with other countries. MIRU-VNTR typing achieved a superior discrimination (h=0.98), specially within frequent spoligotypes, and was able to establish, in accordance with cattle herds data, inter-herd transmission as well as transmission between cattle and game animals, from the same area. By their high discriminatory power, these genotyping techniques are proven to be useful for future molecular epidemiological studies, adding increased effectiveness to eradication strategies in Portugal