Définition des critères d’efficacité d’une hémicellulase pour l’hydrolyse de substrats lignocellulosiques complexes et insolubles

Le développement de technologies enzymatiques constitue un enjeu majeur pour le fractionnement maîtrisé et la valorisation des ressources lignocellulosiques (biocarburants, biopolymères, synthons…). L’efficacité de ces biocatalyseurs est cependant limitée par de multiples facteurs liés à la fois à leurs caractéristiques structurales et fonctionnelles, mais également à la nature complexe de la biomasse lignocellulosique (riche en parois secondaires lignifiées). Dans le but d’identifier les paramètres clés pour une conversion efficace des hémicelluloses, constituants majeurs des lignocelluloses, nous avons centré notre étude sur l’endoxylanase (Tx-Xyl) de Thermobacillus xylanilyticus appartenant à la famille 11 des glycosidehydrolases (GH11). L’efficacité d’une hémicellulase au sein des parois lignifiées est fortement dépendante de la diversité structurale et la complexité organisationnelle des réseaux pariétaux. Afin de préciser les facteurs limitants propres aux lignocelluloses et de mettre en évidence les niveaux d’organisation des polymères lignocellulosiques susceptibles d’entraver ou de limiter l’action de l’enzyme, nous avons étudié, dans une approche biomimétique, l’action de la xylanase GH11 (Tx-Xyl) sur des substrats différents et de complexité croissante (hétéroxylanes isolés, assemblages de copolymères reconstitués in vitro...). L’emploi de nano-composites hétéroxylanes extraits - lignines (DHPs) synthétisés in vitro selon deux modes de polymérisation ("Zulaufverfahren", ZL et "Zutropfverfahren", ZT) nous a permis de révéler différents niveaux d’organisation, morphologies et caractéristiques physico-chimiques des associations polysaccharides - lignines et de souligner l’effet négatif des lignines (DHPs) sur l’hydrolyse des hétéroxylanes par la xylanase (Tx- Xyl). Cet effet se manifeste indépendamment de la nature des associations hétéroxylanes -lignines (covalentes ou non), mais serait accentué par l’agencement tridimensionnel des complexes covalents (LCC) qui limiterait l’accessibilité des hétéroxylanes à l’enzyme. Au-delà des limitations de l’accessibilité, les lignines interféreraient directement avec l’action de l’enzyme via des interactions non spécifiques ou non productives. Une corrélation directe a pu, en effet, être établie entre l’augmentation du contenu en lignines des nano-composites et la baisse de l’activité de l’enzyme. Par ailleurs, l’étude des interactions de Tx-Xyl avec divers acides hydroxycinamiques (p-coumarique, férulique, cafféique…) a permis de mettre en évidence un phénomène d’inhibition non compétitif de l’enzyme par ces composés phénoliques. En plus des paramètres inhérents au substrat, la compréhension des propriétés structurales des enzymes régissant leur action in situ sur les lignocelluloses est indispensable. A l’instar des endoxylanases de la famille GH11, Tx-Xyl est une enzyme constituée d’un domaine catalytique d’environs 20 kDa et elle ne comporte pas de domaine dédié à la fixation au substrat (Carbohydrate Binding Module ou CBM). Moyennant des outils de biologie moléculaire, nous avons développé une stratégie qui vise à modifier l’architecture protéique et/ou la spécificité de fixation de Tx-Xyl en la fusionnant via des séquences "linker" à des modules protéiques différents: le CBM1 de la cellulase Cel7A de Trichoderma reesei fixant spécifiquement la cellulose cristalline et la GFP (Green Fluoerescent Protein). Les protéines chimériques Tx-Xyl-CBM1 et Tx-Xyl-GFP obtenues sont moins efficaces sur les xylanes solubles (faible Kcat) comparées à Tx-Xyl. Cependant, leurs modes d’action sur des substrats lignocellulosiques (tels que les coproduits du blé : paille et son de blé) semblent différents. En effet, des rendements d’hydrolyse légèrement augmentés sont obtenus dans le cas de Tx-Xyl-CBM1, suggérant un impact positif du CBM1 sur la migration et/ou l’action de l’enzyme in situ, contrairement à Tx-Xyl-GFP dont la taille serait un facteur limitant sa diffusion/pénétration au sein des parois végétales.The development of enzymatic technologies offers an alternative, environmentally-friendly interesting strategy for controlled fractionation and upgrading of lignocellulosic biomass (biofuels, biopolymers, industrially-relevant chemicals...). The effectiveness of these biocatalysts is, nevertheless, limited by multiple factors related to their structural and functional characteristics, but also to the complex nature of the lignocellulosic biomass (rich in lignified secondary cell walls). In order to identify the key parameters for an effective bioconversion of hemicelluloses, the major components of lignocelluloses, we have focused our study on the endoxylanase (Tx-Xyl) of Thermobacillus xylanilyticus, a family 11 glycoside- hydrolase (GH11). The effectiveness of hemicellulases within the lignified cell walls is strongly dependent on the structural diversity and organisational complexity of the cell wall networks. In order to specify lignocellulose structural limiting factors and to get more knowledge regarding the impact of the cell wall network organization on the enzyme action of at supramolecular level, we have studied, in a biomimetic approach, the action pattern of Tx-Xyl on different substrates displaying increasing complexity (isolated heteroxylans, in vitro reconstituted copolymer assemblies...). The use of nano-composites of heteroxylans - lignins (DHPs) synthesized in vitro according to two polymerization methods ("Zulaufverfahren", ZL and "Zutropfverfahren", ZT) has enabled us to reveal different organizations, morphologies and physicochemical characteristics of the polysaccharides - lignins associations and to underline the negative effect of lignins (DHPs) on heteroxylan hydrolysis by the xylanase (Tx-Xyl). This effect would be irrespective to the nature of heteroxylans - lignins associations (covalent or not). Nevertheless, the complex supramolecular organization of the covalent complexes (LCC) would severely hamper the enzyme's access to carbohydrates. Otherwise, lignins would interfere directly with the action of the enzyme through nonspecific or not productive interactions. A direct correlation has been, indeed, established between the increase in the lignin content of the nanocomposites and the decrease of the enzyme activity. In addition, the study of the interactions of Tx-Xyl with various hydroxycinamic acids (p-coumaric, ferulic, caffeic acids...) has revealed a non-competitive inhibition of the enzyme by these phenolic compounds. In addition to substrate parameters, understanding the structural properties of the enzymes determining their action in situ on lignocelluloses is essential. As a member of GH11endoxylanase family, Tx-Xyl is a non modular enzyme comprising only a catalytic module (20 kDa) and no Carbohydrate Binding Module (CBM). Using protein engineering, we have developed a strategy which aims at modifying the Tx-Xyl architecture and/or specificity by grafting, through "linker" sequences, different protein modules: the CBM1 of the cellulase Cel7A from Trichoderma reesei binding specifically crystalline cellulose and the GFP (Green Fluoerescent Protein). The chimeric fusion proteins Tx-Xyl-CBM1 and Tx-Xyl-GFP obtained have been less effective on soluble xylans (low Kcat) than Tx- Xyl. However, their efficiency on lignocellulosic substrates (such as wheat by products; straw and bran) was different. Indeed, modestly enhanced hydrolysis rates were obtained in the case of Tx-Xyl-CBM1, suggesting that the CBM1 may potentiate in situ action of the enzyme, contrary to Tx-Xyl-GFP whose size would be a factor limiting its diffusion/action within the cell wall networ