Role of chemerin and its receptors in mouse models of tumorigenesis

Dissertação de Mestrado, Oncobiologia: Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015A chemerin foi identificada no nosso laboratório como sendo uma proteína quimioatraente de células imunitárias. Vários estudos mostraram que esta proteína pode apresentar um efeito inibitório ou promotor de tumores, dependendo do tipo de cancro. Se por um lado, foi mostrado um efeito anti-tumoral em cancros do pulmão, próstata e melanoma, onde a concentração de chemerin está diminuída em pacientes doentes, outro estudo mostra um aumento de chemerin em pacientes com diferentes tipos de cancros gástricos, e por isso, apresenta um efeito pro-tumoral. A chemerin é encodada pelo gene tazarotene-induced 2, e é expressa principalmente no fígado e tecido adiposo, mas também na glândula adrenal, pâncreas, pulmões e pele. O seu precursor, prochemerin, está biologicamente inativo e requer uma clivagem proteolítica para se ativar e tornar-se chemerin. A chemerin tem a capacidade de se ligar a três receptores acoplados a proteína G: ChemR23, GPR1 e CCRL2. ChemR23 é descrito como o principal receptor da chemerin e é expresso em células do sistema imunitário como macrófagos e células natural killer, mas também em células não hematopoiéticas, como adipócitos e células endoteliais. A ligação da chemerin ao receptor ChemR23 promove a internalização do receptor, a mobilização de cálcio e a quimiotaxia de células imunitárias que expressam este receptor. Alguns estudos mostraram funções do sistema chemerin/ChemR23 a nível inflamatório, que pode influenciar a migração das células endoteliais, apresentando um efeito anti-inflamatório. GPR1 é expresso em células do sistema nervoso, placenta, pele, entre outros, mas não em células do sistema imunitário. Este receptor liga-se com elevada afinidade a chemerin, ocorrendo a internalização do receptor. Porém, não foi detetada nenhuma sinalização intracelular. Desta forma, a função deste receptor e a sua interação com a chemerin continua por esclarecer. CCRL2 encontra-se presente em macrófagos, células dendríticas e em células endoteliais. Este receptor liga-se com elevada afinidade a chemerin, mas não ocorre sinalização intracelular nem a internalização do receptor, sugerindo que este receptor é não funcional. Foi mostrado a hipótese que CCRL2 apresenta a chemerin ao receptor ChemR23, e que tem a capacidade de promover a migração de células dendríticas via a chemerin. Com este projeto, pretendemos compreender o papel da chemerin e de dois receptores, CCRL2 e ChemR23, no desenvolvimento tumoral. Para tal, usamos ratinhos deficientes para cada um dos receptores que recebem xenógrafos de linhas celulares tumorais. Este modelo de tumorigenése permitirá analisar quais os processos tumorais afetados por estes receptores, tal como, a proliferação e apoptose de células tumorais, o recrutamento de populações de células imunitárias e a expressão de fatores angiogénicos. Para analisar o efeito da deficiência de ChemR23 no desenvolvimento tumoral, foi injectado um milhão de células provenientes de melanoma (linha B16) nos flancos de ratinhos wild-type e knock-out para ChemR23. Os tumores foram medidos diariamente até dez dias após a implantação. 0Os resultados mostram que os tumores em ratinhos wild-type e knock-out para ChemR23 surgem de forma igual e que desenvolvem de igual forma. Isto sugere que ChemR23 não está envolvido no desenvolvimento tumoral, neste modelo tumoral. Observamos, igualmente, a influência de ChemR23 na migração de células imunitárias atá ao site tumoral, via citometria de fluxo. Os resultados mostraram que a ausência de ChemR23 não afetou a migração de células imunitárias, no geral, nem as diversas subpopulações analisadas, sugerindo que este receptor não influencia a migração das células imunitárias em resposta a um tumor. Estes resultados são consistentes com os resultados observados no crescimento tumoral. Para saber se CCRL2 está envolvido no controlo do desenvolvimento tumoral, um milhão de células B16 foram injetadas nos flancos em ratinhos wild-type e knock-out para CCRL2, observando o desenvolvimento tumoral ao longo de vários dias. Os tumores dos ratinhos wild-type e knock-out desenvolvem-se ao mesmo tempo mas nos ratinhos knock-out os tumores são menores. Estes resultados sugerem que CCRL2 tem um efeito pró-tumoral neste modelo tumoral. Este efeito foi confirmado com outra linha de células tumorais provenientes de carcinoma pulmonar de Lewis, que apresentou resultados semelhantes. Para perceber o efeito de CCRL2 na migração de células imunitárias, analisamos o recrutamento de células imunitárias em tumores de células B16, por citometria de fluxo. As populações de células imunitárias foram analisadas diversos dias após a implantação tumoral (3, 6 e 10 dias). Os resultados das diferentes análises sugerem que tanto a população total de células imunitárias como as diversas subpopulações não são afetadas pela ausência de CCRL2. Estes resultados foram confirmados por microscopia de fluorescência, onde se marcou células imunitárias com anticorpos fluorescentes em cortes de tumores. Os resultados mostraram a mesma proporção de células imunitárias, bem como a mesma distribuição em ambos os grupos de ratinhos. Confirmamos que CCRL2 não afeta o recrutamento de células imunitárias ao realizar a mesma experiência com tumores de células LLC, obtendo assim os mesmos resultados. De forma a perceber o efeito de CCRL2 no desenvolvimento tumoral e a sua influência na migração de células imunitárias, determinamos as consequências do défice de CCRL2 nas concentrações plasmáticas totais de chemerin. Amostras de sangue de ratinhos wild-type e knock-out foram analisadas por ELISA. Os resultados mostraram que a concentração nos dois grupos é igual, sugerindo que a concentração total de chemerin não é afetada por este receptor. Via um teste aequorin e purificação por HPLC (high pressure liquid chromatography), foi analisada a concentração plasmática de chemerin bioativa nos dois grupos de ratinhos, e observou-se que a concentração era similar nos dois grupos. A concentração total de chemerin também foi analisada, por ELISA, após a implantação de células tumorais. Os resultados mostraram um aumento da concentração de chemerin após a implantação tumoral em ambos os grupos de ratinhos. Porém, não foram observadas diferenças da concentração plasmáticas na ausência de CCRL2. Estes resultados sugerem que o efeito observado em CCRL2 não pode ser explicado pela concentração de chemerin plasmática total e ativa, visto que esta não é alterada estas experiências mostram que a diminuição de tamanho de tumores em ratinhos knock-outs não se deve a concentração de chemerin nem a proporções de células imunitárias recrutadas para o site tumoral. Por estar presente em células endoteliais, tentamos perceber a influência de CCRL2 na neo-angiogénese tumoral e as consequências na sobrevivência celular e proliferação tumoral. A proliferação e a apoptose celular foram analisadas por imunofluorescência, em tumores de células B16, a três e a seis dias de desenvolvimento tumoral. Ao analisar a colocalização de células em proliferação, observamos semelhante proliferação em ratinhos wild-type e knock-out, nos dois dias, sem aparentarem diferenças, sugerindo que CCRL2 não afeta este processo. Analisamos a apoptose celular em tumores de células LLC a dez dias de desenvolvimento tumoral, por imunofluorescência. Observamos um aumento de células apoptóticas, na ausência de CCRL2, quando comparado ao grupo wild-type. Observamos também que as regiões apoptóticas estão à periferia das regiões necróticas, que também estão aumentadas, comparando com o grupo wild-type. Estes resultados mostram que CCRL2 parece ter um efeito nos processos de apoptose e na necrose deste modelo tumoral. Bárbara Sofia Marques da Silva ix Estes processos estão correlacionados com a angiogénese tumoral. Desta forma, para entender a interação com CCRL2, observou-se a expressão de fatores angiogénicos em tumores de células LLC a dez dias de desenvolvimento tumoral, por PCR quantitativa. Os resultados mostraram que, na ausência de CCRL2 a expressão de trombospondina-1, VEGFA e FGF2 estão aumentados comparando com o grupo controlo. Estes resultados preliminares sugerem que CCRL2 pode ter uma significante influência no controlo da angiogénese tumoral, moldada pela expressão de fatores angiogénicos, e consequentemente, alterando a apoptose tumoral. Com este trabalho, é possível concluir que ChemR23, receptor principal da chemerin, não influencia o desenvolvimento tumoral nem o recrutamento imunitário, não estando por isso implicado nos efeitos antitumorais da chemerin, neste modelo tumoral. Por outro lado, CCRL2, um receptor não-funcional, apresenta um efeito pró-tumoral no mesmo modelo experimental. Este efeito deve-se a sua influência na angiogénese, que poderá vir a ser explicado pela sua implicação na expressão de trombospondina-1 ou na migração de células endoteliais. Como perspetiva, pretendemos compreender melhor o papel de CCRL2 a nível da angiogénese. Com isto, analisaremos a expressão de outros fatores angiogénicos, a correlação com o TSP1, VEGFA e o FGF2, bem como na influência na migração de células endoteliais para o site tumoral