Neuroendocrinology of cooperation: the role of neuropeptides on the modulation of mutualistic behaviour of the Indo-Pacific Cleaner Wrasse (Labroides dimidiatus)

Tese de doutoramento, Ciências do Mar, da Terra e do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015Interspecific cleaning interactions are a classical textbook example of mutualistic cooperation. One of the most notorious cleaning mutualisms involve the Indo-Pacific Bluestreak cleaner wrasse Labroides dimidiatus, which are known to interact with an average of 2300 visitor reef fish per day. In contrast to the increasing knowledge on the functional aspects of cleaning mutualisms in the last decades, their underlying physiological mechanisms are still relatively rare. One major class of neuromodulators that is involved in the control of social behaviour and that seems to be co-opted for the regulation of cleaning behaviour is a group of nonapeptides of the arginine vasopressin /oxytocin family (AVP/OT). The general aim of this study is to attempt to link functional aspects of decision-making underlying the cleaning behaviour with their proximate mechanisms, namely to determine the contribution of the neuropeptides arginine vasotocin (AVT) and isotocin (IT) for the regulation of adjustments of individual cleaner wrasses’ behavioural output. This study yielded several findings. First, I tested the influence of AVT upon the cleaners’ ability to solve two different problems that in principle differ in ecological relevance and are associated with two different memory circuits and found that AVT affected the learning competence of cleaners as individual performance showed distinct response selectivity to AVT dosage levels. However, only in the ecologically relevant task was their learning response improved by blocking AVT via treatment with the antagonist Manning compound. Next I examined if neuropeptides may be implicated in the mechanisms underlying the adjustment of individuals to the existence of partner control mechanisms in cooperative interactions between unrelated individuals and discovered that solely the experimental transient higher dosage of AVT led to a decrease of cleaners’ willingness to feed against their preference, while IT and AVT antagonists had no significant effects. Then I asked if the establishment of privileged ties and the quality of association between cleaner wrasse pairs is correlated with neuroendocrine mechanisms involving forebrain neuropeptides and whether these neuropeptides level shifts relate to individual’s interspecific service quality. Here I found .that variation in pairs’ relationship influence male and female cleaner fish differently and contribute to the variation of brain neuropeptide levels, which is linked to distinct cooperative outcomes. Finally, I explore the link between these neuroendocrine pathways and the expression of mutualistic behaviour in fishes by comparing the brain quantitative distribution of AVT and IT across the overall and in selected areas of the brain; aiming at four closely related species of labrids that differ in the degree to which they depend on cleaning. The levels of both AVT and IT varied significantly across species, as measured in the whole brain or in specific macro-areas. More importantly, significantly higher AVT levels in cerebellum and in the whole brain were found in the obligate cleaner species, which seems to be related to expression of mutualistic behaviour. Overall, my study suggests that the neuropeptidergic system but mostly AVT pathways play a pivotal role in the regulation of interspecific cooperative behaviour and conspecific social behaviour among stabilized pairs of cleaner wrasses.As interacções interespecíficas de limpeza são exemplos clássicos de cooperação mutualística. Um dos mais emblemáticos exemplos de mutualismo de limpeza envolve o bodião limpador do Indo-Pacífico Labroides dimidiatus que interage em média com cerca de 2300 espécies de peixes do recife de coral por dia. Estes bodiões removem ectoparasitas e tecido infectado ou morto da superfície dos peixes que os visitam (referidos como clientes) e dependem exclusivamente das interações mutualísticas de limpeza para obter o seu alimento. Os bodiões limpadores encontram-se em territórios específicos, designados por estações de limpeza, e vivem num sistema de harém (espécie poliginica e protogínica). As interacções de limpeza são geralmente iniciada pelos clientes, que adoptam uma posição específica ficando imoveis e abrindo a boca, opérculos e barbatanas peitorais, que demostram assim que desejam ser limpos. Por sua vez, os limpadores exibem um comportamento específico de dança, nadando para cima e para baixo, chamando assim a atenção dos seus clientes. Uma estratégia de pré-conflito utilizada pelos limpadores é a da estimulação táctil, durante a qual, usando as barbatanas pélvicas e peitorais, “massajam” o corpo do cliente durante a inspecção, e enquanto o faz não se alimenta. Apesar do crescente conhecimento sobre os aspectos funcionais do mutualismo de limpeza, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos que estão na base destas interações de cooperação. O grupo dos nonapeptidos da família da Arginina vasopressina/ Oxytocina (AVP/OT) é uma classe importante de neuromodeladores que está relacionada com a regulação do comportamento social e que por conseguinte poderá estar envolvida na modelação do comportamento cooperativo de limpeza. Um estudo recente realizado no campo demonstrou que a administração exógena de AVT no bodião limpador contribui para a diminuição as interações de limpeza, sem afectar da mesma forma as suas relações conspecíficas destes limpadores. O principal objectivo deste estudo é relacionar os aspectos funcionais das tomadas de decisão que determinam o comportamento de limpeza com os seus mecanismos proximais, isto é, tentar perceber de que forma os neuropéptidos, a Arginina vasotocina (AVT) e a Isotocina (IT) (homólogos nos peixes da AVP e OT) contribuem para a regulação da flexibilidade das respostas comportamentais dos bodiões limpadores. Em primeiro lugar, testei em laboratório a influência da AVT sobre a capacidade do bodião limpador resolver duas tarefas sociais que diferiam na sua relevância ecológica, e que estão associadas a dois circuitos de memória diferentes. Verifiquei que a AVT influenciou a capacidade de aprendizagem do limpador e o seu comportamento revelou ser sensível a diferentes dosagens deste neuropéptido. Na tarefa de aprendizagem por “pista” - a tarefa ecologicamente relevante - o limpador melhorou a sua aprendizagem quando a AVT foi bloqueada através da administração de um composto antagonista – o composto Manning. Já na aprendizagem espacial, tarefa ecologicamente não relevante para o contexto de limpeza, apenas o tratamento com uma dose baixa de AVT diminui a capacidade de aprendizagem do bodião limpador. Seguidamente, foi examinado, também em condições controladas, se os neuropeptidos estariam implicados nos mecanismos que ajustam o controlo exercido pelos parceiros sociais envolvidos neste tipo de interação interspecífica. Os bodiões limpadores preferem o muco (com alto valor energético) aos ectoparasitas mas a fim de assegurarem relações duradoiras com os seus clientes precisam comer contra a sua preferência, controlando a impulsividade de ingerirem apenas o que preferem. Verificou-se que apenas uma dose elevada de AVT levou os bodiões limpadores a comerem menos vezes contra a sua preferência. Os antagonistas da AVT e da IT não revelaram ter resultados significativos. Depois foi estudado (em condições naturais) se o estabelecimento de ligações privilegiadas e a qualidade da associação dos casais de bodiões limpadores estariam relacionados com os mecanismos neuro endócrinos que envolvem os neuropétidos no forebrain (área cerebral associada ao comportamento social) e ainda se os níveis de neuropéptidos nesta área cerebral influenciariam a qualidade do serviço de limpeza prestado quando limpavam sozinhos. Ficou demonstrado que a variação do índex de associação dos casais de limpadores influencia machos e fêmeas de forma distinta e contribui para a variação dos níveis de neuropeptidos no cérebro, que por sua vez leva a respostas comportamentais diferentes. Os machos L. dimidiatus que estabeleciam pares com maior índice de associação tinham também valores de IT e eram mais desonestos (comiam a favor da sua preferência) com maior frequência. De igual modo, as taxas de “batota” das fêmeas pareceram relacionar-se com os seus níveis de IT no forebrain, mas menos dependentes do índice de associação. Fêmeas com valores mais elevados de IT e AVT demonstraram ser mais desonestas, mas contrariamente aos machos, as fêmeas apresentaram mais “batoteiras” pertenciam a casais onde existiam maior instabilidade. Por último analisei a ligação entre as vias neuroendocrinas e a expressão do comportamento mutualístico ao comparar os níveis de AVT e IT no cérebro (como um todo e nas diferentes áreas cerebrais que o compõem) em quatro espécies de labrídeos próximos filogeneticamente mas que diferem na expressão do comportamento de limpeza (L. dimidiatus e Labroides bicolor – limpadores obrigatórios, Labropsis australis limpador facultativo e um não limpador - Labricthys unilineatus). Verificou-se que os níveis de AVT e IT variavam significativamente entre espécies quando medidos como um todo e em cada uma das macroáreas cerebrais (cerebelo, tecto óptico, tronco cerebral e forebrain). Os limpadores obrigatórios, L. dimidiatus e Labroides bicolor, apresentaram níveis de AVT significativamente maiores no cerebelo e no cérebro total, o que pode estar relacionado com a expressão do comportamento mutualístico. Os níveis de IT não parecem estar relacionados directamente com a expressão do comportamento mutualístico mas os valores elevados de IT no L. unilineatus sugerem que estes nonapéptidos poderão estar relacionados com o desenvolvimento do dimorfismo sexual, que apenas existe na espécie de não limpador (todas as outras espécies são monomórficas). Em resumo, o meu estudo sugere que o sistema neuropeptidergico, em especial as vias neuronais de AVT desempenham um papel crucial na regulação do comportamento cooperativo interespecífico e comportamento social conspecifico entre casais estáveis de bodiões limpadores.SFRH/BD/41683/200