Contribution of the intracellular cholesterol levels for the expression of VEGF-C and VEGFR-3 in acute myeloid leukemia

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2013Some subsets of Acute Myeloid Leukemia (AML) cells express the Vascular Endothelial Receptor 3 (VEGFR-3), a receptor for the Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C). The VEGFR-3/VEGF-C axis has been related to many cancers, including leukemia, due to the promotion of cell proliferation, chemotherapy resistance and tumor aggressiveness. At the molecular level VEGF-C signaling has been shown to induce the expression of the Bcl-2 anti-apoptotic factor. Cholesterol has been reported to modulate the expression of VEGFR’s in AML. Here, we hypothesize that intracellular cholesterol levels could modulate signaling through the VEGFR-3/VEGF-C axis, contributing towards increased leukemia aggressiveness. To test this hypothesis we either enriched or partially depleted cholesterol from the THP-1 and HEL cell lines with Methyl-β-Cyclodextrin + cholesterol complexes and Methyl-β-Cyclodextrin alone, respectively. It was seen that Methyl-β-Cyclodextrin compromises cell viability, so we tested concentrations of 0,2 mM. In these conditions we looked at VEGFR-3, VEGF-C and Bcl-2 expression by RQ-PCR and Western Blot; VEGFR-3 expression was also assessed by flow cytometry. Our preliminary results show that cholesterol enrichment of cells leads to a decrease of VEGFR-3 mRNA levels, while cholesterol depletion leads to an increase of VEGF-C mRNA levels. No differences in Bcl-2 have been detected. We are now confirming these results at the protein level. By flow cytometry VEGFR-3 expression didn’t show differences between conditions. Subsequent experiments will include in vitro functional assays to assess cell viability, proliferation and resistance to apoptosis. This work may contribute to better understand how VEGF-C signaling pathways are regulated in leukemia. As VEGF-C expression has been associated with resistance to chemotherapy by AML cells, this work may contribute to better understand how resistance is achieved.A Leucemia mieloide aguda (LMA) é um tipo de cancro que ocorre nas células hematopoiéticas da linhagem mieloide, devido a alterações malignas no processo normal de hematopoiese na medula óssea (MO). Variadas alterações genéticas estão na origem do processo de transformação das células hematopoiéticas mielóides em células malignas, denominadas por blastos ou mieloblastos. Estas células sofrem uma paragem no ciclo celular e adquirem a capacidade de proliferar indefinidamente assim como a capacidade de resistência à apoptose, permanecendo num estado indiferenciado e extremamente proliferativo. A elevada proliferação de mieloblastos leva à sua acumulação na MO e posteriormente no sangue periférico, alterando a hematopoiese normal, o que leva a um défice na produção das células do sangue e consequentemente a desordens como trombocitopenia, anemia ou granulocitopenia. Um dos maiores desafios que esta patologia apresenta actualmente é a resistência à quimioterapia. Vários fatores têm sido indicados como relevantes na aquisição de resistência aos fármacos utilizados atualmente na terapia, por parte das células leucémicas. Neste trabalho é focada a família de factores de crescimento VEGF (Vascular Endothelial Growth Factors), nomeadamente o VEGF-C e o seu receptor VEGFR-3. Alguns sub-tipos de LMA expressam VEGFR-3 e produzem VEGF-C, estando colocada a hipótese da existência de um loop autócrino que estará a modelar a sobrevivência de células leucémicas. Inicialmente indicado como promotor de linfangiogénese durante o desenvolvimento embrionário, a sinalização do VEGF-C através do VEGFR-3 tem sido mais recentemente relacionada com a progressão e agressividade de vários tipos de cancro, estando ligada à proliferação, sobrevivência e consequente resistência a drogas citotóxicas pelas células de LMA. Estudos em LMA pediátrica estabeleceram que o aumento dos níveis de VEGF-C endógeno nas células leucémicas está relacionado com a diminuição da resposta aos fármacos, revelando uma influência do factor na sobrevivência destas células. Ao nível molecular, a sinalização de VEGF-C demonstrou induzir a expressão do factor anti-apóptotico Bcl-2, que está sobre expresso em variados tumores e está relacionado com o processo de tumorigénese e resistência à quimioterapia. Adicionalmente, o colesterol intracelular tem demonstrado proteger células de LMA dos efeitos citotóxicos dos fármacos e estas células apresentam um metabolismo de colesterol desregulado, com aumento dos níveis de colesterol intracelular após exposição aos fármacos. A sinalização através do VEGFR-1 é mediada pelos níveis de colesterol intracelular em células de LMA, e elevados níveis de colesterol aumentam a activação deste receptor, contribuindo para a expansão e desenvolvimento da doença, o que sugere uma relação entre os níveis de colesterol celular e receptores da família VEGF. Uma vez que também o receptor VEGFR-3 está implicado na progressão de LMA, é importante compreender de que forma o colesterol celular estará a modelar a sua expressão, assim como de que forma poderá estar a modelar a produção do seu ligando VEGF-C, nas células leucémicas. A existência de uma modulação da produção de VEGF-C nas células pelo colesterol poderá sugerir um envolvimento deste na indução da expressão do factor anti-apóptotico Bcl-2 pelo VEGF-C, e subsequente resistência à quimioterapia. O objectivo do presente estudo passa por compreender de que forma o colesterol intracelular está a afectar a expressão dos factores VEGF-C, VEGFR-3 e Bcl-2 em células leucémicas, no sentido de compreender melhor a importância dos níveis de colesterol para estas células, e que relevância poderá ter para a actividade biológica destes factores. Como modelo de estudo para LMA foram utilizadas duas linhas celulares, HEL (Human Erythroleukemia) e THP-1 (Human Monocytic Leukemia), e a estratégia utilizada passou pelo enriquecimento e pela remoção parcial de colesterol destas células com complexos de colesterol + Metil-β-Ciclodextrina e Metil-β-Ciclodextrina, respectivamente. O tratamento das células com Metil-β-Ciclodextrina reduz a viabilidade das células e por isso foram utilizadas baixas concentrações (0.2 mM) durante períodos de tempo de 4 horas. Os níveis de colesterol das células foram sempre medidos após a exposição aos complexos de colesterol + Metil-β-Ciclodextrina e Metil-β-Ciclodextrina para confirmar a eficiência do respectivo enriquecimento e parcial remoção. Os níveis de expressão de VEGFR-3, VEGF-C e Bcl-2 foram analisados nas duas condições de colesterol celular por PCR quantitativo (PCRq); os níveis de VEGF-C foram ainda analisados por Western-blotting e os de VEGFR-3 por citometria de fluxo. Os resultados preliminares deste estudo demonstram que o enriquecimento das células leucémicas com colesterol promove a diminuição dos níveis de mRNA VEGFR-3, enquanto que a remoção parcial de colesterol promove um aumento dos níveis de mRNA do VEGF-C. Não foram detectadas diferenças na expressão de Bcl-2, o que demonstra que esta parece não ser afectada pelos níveis de colesterol celular. A expressão de VEGFR-3 através da análise por citometria de fluxo não demonstrou diferenças entre as duas condições de colesterol. Em suma, estes resultados demonstram um aumento do VEGF-C endógeno quando é removido colesterol das células leucémicas, indicando uma modelação da sua produção pelos níveis de colesterol celular. Os níveis de VEGFR-3 são afectados pelas alterações de colesterol apenas ao nível do mRNA, o que indica que a modelação de VEGFR-3 pelo colesterol é feita ao nível do mRNA. No entanto, são necessárias mais abordagens para compreender que funções celulares estão a ser modeladas pelas alterações de expressão verificadas, nomeadamente ensaios funcionais in vitro para analisar a proliferação celular e a resistência à apoptose, no sentido de investigar que relação poderá existir entre o que foi observado e a resistência à quimioterapia. Este trabalho deverá assim contribuir para uma melhor compreensão de como as vias de sinalização do VEGF-C são reguladas na leucemia. Uma vez que a expressão de VEGF-C tem sido associada à resistência à quimioterapia é importante explorar as questões obtidas neste estudo, para uma melhor compreensão de como as células de LMA resistem aos fármacos citotóxicos