Gluconeogenesis and amino acids metabolism in ovarian clear cell carcinoma

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2013Tumor cells may exhibit different metabolic profiles compared to normal tissues from which they are derived. Those observations gave rise to the new concept that tumorigenesis requires metabolic alterations to sustain cell proliferation. Several studies reveal that increased cell proliferation is accompanied by increased glucose consumption. In OCCC, a typical morphological feature is the accumulation of glycogen in cancer cells cytoplasm this fact allows us to raise the stepwise questions: 1) Is glucose the main energy and carbon source used by OCCC?; 2) Being glucose a relevant energy and carbon source, can gluconeogenesis be working on ovarian clear cell carcinoma?, and 3) If gluconeogenesis is working on, which are the gluconeogenic substrates used by ovarian clear cell carcinoma? In the present thesis we try to clarify, in an OCCC in vitro model (ES2) and in a glucose privation microenvironment, if gluconeogenesis pathway is working on, in order to support cells energy demands. Glutamine, lactate and butyrate were testes as putative gluconeogenesis substrates. Metabolic analysis by NMR of ES2 cell line showed the presence of glycogen, characteristic of this cell line, though 13C unlabelled, meaning that it was not synthesized from the tested substrates. At the same time the tested time points were not enough to clarify if glucose is de novo synthesized through gluconeogenesis. Nevertheless, NMR results showed that glutaminolysis was the major pathway used to sustain ES2 cell proliferation, with the production of TCA intermediates, as well as intermediates for macromolecular synthesis. These findings prompted us to investigate the role of glutaminolysis in OCCC. In NMR analysis, we observed the synthesis of glycine and glutamate as well as the synthesis of GSH. Gathering cysteine to cells exposed to glutamine, we verified an increase in the synthesis of GSH. In cancer, GSH high levels is related to drug resistance which is in agreement with the fact that OCCC poor prognosis is also due to resistance to therapy. Summing up, amino acids can play a central role in OCCC concerning energy and carbon metabolism as well as drug resistance.O cancro é considerado como um dos maiores problemas de saúde pública (Siegel et al., 2013). De acordo com a OMS (Organização Mundial de Saúde) o cancro é caracterizado como sendo um crescimento anormal de células, podendo desenvolver-se em qualquer parte do corpo e alastrar-se para outros órgãos (metástases). Sabe-se ainda que as metástases são maioritariamente responsáveis pela morbilidade e mortalidade em doentes com cancro (Seyfried and Shelton, 2010). Biologicamente, as células normais podem sofrer transformação maligna, sendo em parte esta transformação influenciada pelo microambiente envolvente, onde o tumor e as células circundantes estabelecem uma rede funcional (Hanahan and Weinberg, 2011; Serpa and Dias, 2011). O carcinoma do ovário, é uma grande causa de mortalidade em mulheres, constitui cerca de 90% de todas neoplasias malignas do ovário, sendo 3-10% dos casos classificados como carcinoma de células claras (OCCC). Cerca de 57-81% de OCCC são diagnosticados nos estádios I/II, apresentando-se usualmente como uma massa pélvica. Doentes com CCC apresentam um comportamento clínico distinto e com pior prognóstico do que outras neoplasias de ovário (Feeley et al., 2001, Bjorkholm et al., 1982; Sorbe et al., 1982; Hogberg et al.,1993). Um dos motivos que contribuem para o mau prognóstico em CCC está relacionado com a baixa resposta à quimioterapia convencional baseada em cis-platina (Goff et al., 1996). Este tipo histológico de carcinoma do ovário deve o nome de células claras a algumas alterações morfológicas devidas à acumulação de glicogénio, cuja síntese é regulada pelo HNF1 (hepatocyte nuclear factor 1), o gene central na tumorigénese do CCC (Anglesio et al., 2011). Atualmente sabe-se que as células tumorais poderão apresentar perfis metabólicos distintos das células normais (Fuchs and Bode, 2005). Em 1956, Otto Warburg estabeleceu o primeiro elo de ligação entre o metabolismo e o cancro através das observações em que as células tumorais, mesmo na presença de oxigénio, apresentam um aumento da taxa da glicólise, tendo lactato como produto final (Warburg, 1956). Este fenómeno, conhecido como efeito de Warburg, coloca a hipótese das células tumorais apresentarem defeitos na mitocôndria, responsável pela anulação do ciclo TCA (ou ciclo de Krebs) e consequentemente aumento da taxa de glicólise (Vander Heiden et al., 2009), suportando a proliferação celular. Em vários tipos de cancro, existe uma associação entre o desregulação e aumento da proliferação /sobrevivência celular com um aumento da glicólise aeróbica (Wise and Thompson, 2010), onde as fontes de carbono, NADPH e ATP provêm da glucose (Dang, 2012). A glucose e a glutamina são os principais substratos a serem utilizados como fontes de ATP e carbono, essenciais à síntese de macromoléculas e ao suporte da proliferação celular. A glucose é responsável pela produção de ribose (fundamental para a síntese de ácidos nucleicos) e ATP, através da via das pentoses-fosfato (PPP). A glutamina, o aminoácido mais abundante na corrente sanguínea, é considerado um substrato bioenergético e dador de nitrogénio, sendo que este aminoácido se revela essencial para a produção de biomassa e energia (Dang, 2012). A neoglucogénese é responsável por cerca de 35-50% da produção total de glucose, sendo uma via que requer ATP e NADPH para a conversão de piruvato, lactato e aminoácidos (como alanina e glutamina) em glucose de novo. Nos tecidos normais, a neoglucogénese é ativada por modificações pós-translacionais ou pela ativação alostérica de enzimas chave limitantes, responsáveis pelos eventos moleculares desta via. Geralmente, e de acordo com os requisitos metabólicos, os órgãos adaptam a importação, armazenamento, produção e libertação de glucose (Oh et al., 2013; Telang et al., 2012). A conversão de piruvato em glucose é considerada como o maior passo da neoglucogénese, sendo catalisado por várias enzimas citoplasmáticas e mitocôndriais. Parte dos passos da neoglucogénese são catalisadas, no sentido inverso, por enzimas glicolíticas (Quintas et al., 2008a). A nível molecular, o piruvato é transportado diretamente do citoplasma para a mitocôndria ou, tendo a alanina como percursor, a conversão para piruvato ocorre na mitocôndria por transaminação. O piruvato promove a formação de oxoloacetato (OAA) por ação da piruvato carboxilase (PC). O transportador carnitina permite o influxo de acetil-CoA na mitocôndria, que servirá como um activador essencial de PC. OAA é então reduzido a malato e transportado para o citoplasma via transportador malato--cetoglutarato. No citoplasma, o malato é oxidado a OAA e posteriormente a fosfoenolpiruvato (PEP), através de fosfoenolpiruvato carboxicinase citosólica (PCK1). Caso o OAA seja convertido diretamente no citoplasma, a conversão a PEP é catalisada por fosfoenolpiruvato carboxicinase mitocondrial (PCK2). A conversão de fructose-1,6-bifosfato (F1,6BP) em fructose-6-fosfato (F6P) pela fructose-1,6-bifosfatase (FBP1) é outra reação irreversível na neoglucogénese (Quintas et al., 2008b). Posteriormente, glucose-6-fosfatase (G6Pase) é então responsável pela desfosforilação de F6P em glucose de novo (Weickert and Pfeiffer, 2006). Por sua vez, a função da enzima 6-fosfofructo-2-cinase/ fructose-2,6-bifosfatase (PFKFB1) está associada à estimulação da glicólise e inibição da neoglucogénese, através da modulação da sua atividade cinase. A glutamina pode ser considerada tão importante como a glucose a nível da produção de energia, estando provado que restrições de glutamina ou inibição de enzimas glutaminoliticas diminuem a proliferação celular, tanto in vitro como in vivo (Reynolds et al., 2013). Os passos fundamentais da glutaminólise são a hidrólise de glutamina a glutamato, por ação da glutaminase (GA), e a subsequente conversão na mitocôndria do glutamato em -cetoglutarato (-KG). -KG pode integrar o ciclo TCA e fornecer os intermediários metabólicos, como NADH (Piao et al., 2013). Porém, um metabolismo oxidativo incompleto pode conduzir à produção de lactato como produto final. O glutamato pode ainda ser convertido em piruvato pela transaminase glutamato-piruvato (GPT) e ser usado como substrato para a neoglucogénese (Matés et al., 2013). O glutatião (GSH) é um tripeptido γ-glutamil-cisteinil-glicina, sendo considerado o antioxidante mais importante do organismo. GSH, um tiol antioxidante intracelular, atua como tampão redox contra o stress oxidativo. Alterações moleculares no sistema GSH em alguns tumores pode ser responsável por um aumento da proliferação celular, bem como da resistência a drogas (Traverso et al., 2013). A cisteína, um aminoácido utilizado na síntese de GSH, é obtido através da dieta ou da transulfuração de outros amino acidos. A transulfuração desempenha um papel importante na homeostase de cisteína, sendo mediada em parte pela cis-tationa-gama-ligase (CTH) e 3- sulfotransferase de mercaptopiruvato (MPST). CTH é uma enzima citoplasmática e a última enzima-chave na via de transulfaração, catalisando a conversão de cistationina (derivada da metionina) em cisteína, amónia, 2-oxobutirato e é ainda responsável pela produção de H2S (Wang and Hegele, 2003). A CTH tem ainda a capacidade de degradar cisteína, o que conduz à produção de lactato (Steegborn, 1999). Por sua vez, MPST é uma enzima envolvida da degradação da cisteína, catalisando a transferência de ião enxofre do 3-mercaptopiruvato em cianina ou outro tiol (Jurkowska et al., 2011). Com base no trabalho científico que vem sendo dedicado na área do metabolismo tumoral nesta tese foram definidos dois objectivos principais que foram abordados, utilizando um modelo in vitro de OCCC (ES2). O primeiro objectivo é verificar se a neoglucogénese é a fonte de glucose, de modo a suportar as necessidades celulares. Investigámos a glutamina, lactato e butirato como substrato da neoglucogénese, bem como o perfil de expressão de enzimas chave da neoglucogénese (PCK1, PCK2, FBP1 e PFKFB1) e a modulação de características celulares como a migração e ciclo celular. O segundo objetivo, que partiu dos resultados obtidos no primeiro objetivo, e é clarificar a importância do metabolismo da glutamina e da cisteína e a sua influência na síntese de GSH. Pretendemos ainda determinar a relevância da glutamina e cisteína na via de síntese de GSH, bem como na progressão tumoral. O perfil metabólico de ES2 por NMR revelou a presença de glicogénio não marcado, assim como também não foi detetada glucose 13C marcada, o que é indicativo de que as células não estão a recorrer aos substratos testados como fonte para neoglucogénese. Ao nível das enzimas neoglucogénicas, a acetilação de PCK1 pode ser responsável pelos resultados obtidos, onde maiores níveis de expressão de mRNA PCK1 nas condições de glucose e butirato não se refletiram num aumento dos níveis proteicos de PCK1, sendo por sua vez verificado um aumento dos níveis proteicos de PCK1 na condição lactato e glutamina. Em relação ao PCK2, os resultados suportam o descrito na literatura, em que a expressão de PCK2 permanece praticamente inalterada, sendo porém a sua expressão mais acentuada quando a neoglucogénese recorre ao lactato como substrato. Os nossos resultados também sugerem que quando as células estão num meio privado de glucose os níveis proteicos de FBP1 encontram-se sobre expressos, enquanto que os níveis de PFKFB1 permanecem baixos, estimulando a neoglucogénese. No geral, a nível da modulação de enzimas envolvidas na neoglucogénese o lactato parece ser o principal substrato. Como referido anteriormente, a alanina também pode ser usada como substrato da neoglucogénese, através da conversão de alanina em piruvato, via transaminação. Observámos um aumento nos níveis de mRNA de transaminase de alanina (ALT), nas condições glucose, lactato e glutamina, o que sugere que a alanina também desempenha um papel importante como precursor da neoglucogénese. A análise de NMR permitiu ainda verificar que ES2 são capazes a metabolizar (pelo menos parte) o butirato, favorecendo o ciclo celular e a migração. Por sua vez, e de acordo com os resultados obtidos por NMR, a glutamina parece ser o substrato mais usado. A análise metabólica revelou que a glutamina foi metabolizada em intermediários do ciclo TCA 13C marcados, bem como intermediários 13C marcados para a síntese de macromoléculas, o que sugere que a glutamina é metabolizada pela glutaminólise em vez de ser utilizada como substrato para a neoglucogénese. Os resultados obtidos tambem confirmam que a glutaminólise favorece a migração celular e a progressão do ciclo celular. O perfil metabólico de ES2 revelou ainda a presença intracelular de GSH 13C marcado nos resíduos de glicina e de glutamato, bem como glicina 13C marcada e glutamato13C livres. Observámos que a suplementação de cisteína conduziu a um aumento dos níveis de GSH, que se encontra associado à proliferação e ciclo celular. Detetámos ainda que na presença de cisteína, ocorre um aumento da síntese GSH, que especulativamente estará associado ao decréscimo dos níveis de metionina no interior das células. Assim, o modelo in vitro de OCCC revelou que a glutaminólise parece ser relevante, não só ao nível da produção de energia e de manter o potencial redox favorável, mas também está associada à síntese de GSH, sendo por sua vez, a síntese de GSH favorecida pela suplementação de cisteína. Resumindo, o metabolismo de aminoácidos revelou-se crucial na tumorigénese de OCCC, bem como na resistência a drogas anti tumorais