Application of molecular tools for detection of plant viruses

Grapevine leafroll disease (GLRD) is one of the most important virus diseases of grapevines worldwide, causing major economical impact. The disease has a complex aetiology and currently eleven phloem-limited viruses, termed in general Grapevine leafroll-associated virus (GLRaVs), have been identified. Two of the GLRaVs, GLRaV-1 and GLRaV-3, are included in the European certification scheme of propagation material. However, the flawed notion that GLRaV-3 is more frequent than GLRaV-1 and that all other GLRaVs are possibly not as relevant for GLRD, has until now precluded the development of specific serological and molecular detection assays and limited the scope of molecular characterization of the viruses known to be associated with the disease. Hence, few studies have addressed the phylodynamics of GLRaVs or even characterized the genetic structure of their natural populations. This generalized lack of molecular information, in turn underlie the deficient capacity to detect the viruses. The phylogenetic analyses were conducted on the basis of the heat shock protein 70 homologue (HSP70h) and the coat protein (CP) genes for GLRaV-1 and the HSP70h, the heat shock protein 90 homologue (HSP90h) and the CP genes for GLRaV-5. The data obtained for GLRaV-1 contributed 83 new CP sequences. This information was combined with previous analysis by other authors and used for the production of new polyclonal IgG, capable of detecting CP variants from all the phylogroups observed. Successful testing of this new tool included tissue print immunoblotting (TPIB) and in situ immunoassay (ISIA). The data obtained for GLRaV-5, contributed 61 new CP and 28 new HSP90h gene sequences. Eight phylogenetic groups were identified on the basis of the CP. Characterization of the genetic structure of the isolates revealed a higher diversity than previously reported and allowed the identification of dominant virus variants. For both GLRaV-1 and GLRaV-5, the effect of vegetative propagation on the virus transmission dynamics was addressed.A Doença do Enrolamento da Videira (GLRD) é uma das mais importantes doenças virais que afectam as videiras a nível mundial, causando um grande impacto económico. A doença tem uma etiologia complexa e, actualmente, onze vírus associados ao floema, designados por Grapevine leafroll-associated virus (GLRaVs) foram identificados. Dois dos GLRaVs, os GLRaV-1 and GLRaV-3, estão incluídos na lista de vírus de certificação obrigatória em material de propagação vegetativa indicada pelo esquema de certificação de material de propagação da União Europeia. Contudo, a ideia imprecisa de que o GLRaV-3 é mais frequente que o GLRaV-1 e que, todos os outros GLRaVs, possivelmente, não serão tão revelevantes para a GLRD, tem excluído o desenvolvimento de análises de detecção serológica e molecular e limitado a caracterização molecular dos vírus associados à doença. Deste modo, poucos estudos trataram a filodinâmica dos GLRaVs ou caracterizaram a estrutura genética das suas populações naturais. Por seu turno, a falta generalizada de informação molecular é subjacente à deficiente capacidade de detecção dos vírus. Para o GLRaV-1, as análises filogenéticas foram efectuadas com base no gene que codifica a heat shock protein 70 homologue (HSP70h), bem como no gene que codifica a proteína da cápside (CP). Para o GLRaV-5, as análises foram realizadas com base nos genes que codificam a HSP70h, a heat shock protein 90 homologue (HSP90h) e a CP. Os dados obtidos para o GLRaV-1 contribuíram com 83 novas sequências da CP. Esta informação, juntamente com análises anteriores relizadas por outros autores, foi utilizada para produzir um novo IgG policlonal, capaz de detectar as variantes da CP de todos os filogrupos observados. Esta nova ferramenta de detecção foi testada com êxito por tissue print immunoblotting (TPIB) e por in situ immunoassay (ISIA). A informação obtida para o GLRaV-5, contibuiu com 61 e 28 novas sequências da CP e HSP90h, respectivamente. Oito grupos filogenéticos foram identificados com base na CP. A caracterização da estrutura genética dos isolados revelou uma maior diversidade que a anteriormente publicada e permitiu a identificação de variantes virais dominantes. O efeito da propagação vegetativa na dinâmica de transmissão do vírus, foi analisado para o GLRaV-1, bem como para o GLRaV-5