Biochemical and biological characteristics of novel piscine forms of parathyroid hormone and parathyroid hormone related peptide: a proteomic approach

Tese de dout., Biologia (Biologia Molecular), Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2010Vertebrate bone remodeling and development is a fundamental physiological process which is regulated by multiple factors. Homologues of mammalian parathyroid hormone (PTH)/ parathyroid hormone related peptide (PTHrP) which have a role in skeletal homeostasis have been identified in teleosts but their function is poorly understood. This dissertation describes the biochemical characterization of PTH/ PTHrP family from an advanced teleost, sea bream. Recombinant His-tag PTHA\PTHB and PTH-L proteins were produced using a prokaryotic expression system. In silico analysis predicted a secondary structure for PTHA and PTHB composed of -helix and random coils which was confirmed by biophysical studies of the recombinant proteins. A reference proteome of acellular sea bream bone was generated using 2D electrophoresis coupled to MALDI-TOFF analysis and the way in which sea bream recombinant PTHrP modifies the bone proteome was established. Approximately 300 proteins were mapped in the bone proteome and 125 proteins were analysed of which 94.4% matched proteins in public databases (118). Comparison of control and PTHrP treated fish revealed 8 differentially expressed proteins and the results suggest that global proteome analysis identified novel PTHrP regulated pathways in fish bone. To establish the physiological function of piscine CRTAC2 (Cartilage acidic protein 2), which is a homologue of mammalian CRTAC1 (chondrocyte marker) a recombinant protein was produced. The secondary structure of the soluble recombinant protein contained 9% -helix, 32% - sheet and 58% unordered protein and it had a hyperthermostable tertiary structure. Western blot revealed CRTAC had a widespread tissue distribution and was abundantly expressed in kidney and liver and that the native protein exists in tissue extracts as high molecular weight aggregates. Preliminary physiological studies in fish revealed that sbCRTAC2 in common with collagen I favors outgrowth of epithelia and highlights a possible function which will be studied in the future.Em vertebrados, o processo de remodelação e desenvolvimento ósseo é um mecanismo fisiológico fundamental regulado por múltiplos factores. Nos mamíferos, a hormona da paratiróide (PTH) e a hormona relacionada com a paratiróide (PTHrP) desempenham um papel essencial na homeostase do esqueleto. Recentemente, foram identificados em peixes teleósteos, genes homólogos aos dos mamíferos embora o as suas funções continuem por esclarecer. Esta tese descreve a caracterização bioquímica dos membros da família PTH/PTHrP da dourada (Sparus auratus), um peixe teleósteo. Foram produzidas proteínas recombinadas His-tag PTHA\PTHB e PTH-L, utilizando-se um sistema de expressão procarióta. As análises in silico realizadas indicaram estruturas secundárias para as proteínas PTHA e PTHB constituídas, essencialmente, por hélices- e por estruturas proteicas não ordenadas, que foram posteriormente confirmadas por estudos biofísicos utilizando as proteínas recombinadas produzidas neste estudo. Foi produzido um proteoma de referência a partir de osso acelular de dourada utilizando-se electroforese 2D e análise MALDI-TOFF e o perfil de modulação proteica do efeito da PTHrP recombinada de dourada no proteoma do osso foi caracterizado. Cerca de 300 proteínas foram mapeadas no proteoma do osso. Foram analisadas 125 proteínas, das quais 94,4% foram identificadas como proteínas homólogas em sequências disponíveis em bases de dados públicas (118). Foram identificadas no proteoma da vértebra de dourada oito proteínas diferencialmente expressas entre peixes controlo e peixes tratados com PTHrP. Os resultados obtidos sugerem que a análise global do proteoma permite a identificação de novos genes regulados pela PTHrP no osso de peixes. Neste estudo, a proteína recombinada CRTAC2 (Proteína acídica da cartilagem 2) de peixes foi produzida de modo a estabelecer-se a sua função fisiológica. A CRTAC2 é a proteína homóloga, em sequência, da CRTAC1, um marcador de condrócitos em mamíferos. A proteína recombinada solúvel produzida possui na sua estrutura secundária 9% de hélice- , 32% de folha- e 58% de estruturas proteicas não ordenadas, com uma estrutura terciária hipertermoestável. Análises por Western blot mostraram que a CRTAC2 possui uma distribuição tecidular dispersa, encontrando-se em abundância no rim e no fígado e que a proteína nativa está presente em extractos de tecidos como um agregado de elevado peso molecular. Em peixes, estudos fisiológicos preliminares indicam que a CRTAC2, em comum com o colagénio tipo I, parece favorecer o crescimento epitelial sendo esta uma possível função que deverá continuar a ser estudada no futuro.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT