Efeito da proteína anticongelante tipo I (AFP I) na criopreservação de embriões e blastómeros de teleósteos

Dissertação de mest., Biologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2007Actualmente, a criopreservação de embriões de peixes é um objectivo de grande relevância para as empresas de aquacultura, mas até à data não existem resultados positivos, apesar dos esforços desenvolvidos por vários grupos situados em diferentes países. Uma das principais razões para este acontecimento é a elevada sensibilidade dos embriões à refrigeração, realçando a necessidade de testar diferentes métodos e agentes crioprotectores (CPAs) alternativos, de forma a melhorar a possibilidade de alcançar este fim. Neste trabalho, usou-se a proteína anticongelante tipo I (AFP I) como crioprotector natural. Esta proteína é naturalmente expressa nas espécies de peixes do Árctico, inibindo o crescimento dos cristais de gelo e a recristalização durante o descongelamento. Embriões de Sparus aurata (dourada) foram microinjectados com AFP I em estádios de desenvolvimento diferentes, 2 células e blástula, na interface blastoderme-vitelo e saco vitelino, respectivamente. Embriões controlo, apenas manipulados (picados pela microagulha, mas sem microinjecção) e microinjectados foram submetidos a refrigeração a duas temperaturas diferentes, 0 ºC (1h) e -10 ºC (15min) a partir do estádio de 17 somitos. Estes embriões foram submetidos a -10 ºC em 3M DMSO de forma a evitar a formação de cristais de gelo na solução extracelular. A sobrevivência após refrigeração foi estabelecida como sendo a percentagem de embriões eclodidos. Para estudar a distribuição da AFP I nos embriões microinjectados realizou-se um estudo por microscopia confocal. Os resultados demonstraram que AFP I pode incrementar significativamente a resistência ao frio a 0 ºC, particularmente nos embriões microinjectados em 2 células, apresentando taxas de eclosão próximas de 100%. Este facto encontra-se de acordo com as imagens de microscopia confocal, as quais confirmam a presença da proteína nas células embrionárias e suportam a hipótese de que esta proteína protege as estruturas celulares através da estabilização das membranas. A criopreservação de blastómeros é uma alternativa fiável à criopreservação de embriões. Neste estudo, blastómeros de peixe zebra em 50% epibolia foram submetidos a diferentes tratamentos: (1) PBS 30min TA; (2) 2M DMSO 30min TA e (3) 10mg/ml AFP I em 2M DMSO. A toxicidade dos CPAs e viabilidade celular foi analisada após a criopreservação. A presença de AFP I na solução crioprotectora incrementou significativamente a sobrevivência celular após a vitrificação. A electroporação das células na presença dos CPAs, incluindo AFP I, não conduziu a nenhum melhoramento na sobrevivência celular após vitrificação, tendo um impacto negativo em alguns dos casos estudados. Este estudo demonstra que o uso da proteína AFP v I é vantajoso na criopreservação de blastómeros de peixes, incrementando a resistência ao frio para determinadas temperaturas