Molecular typing and pathogenic potencial evaluation of Listeria monocytogenes

Doutoramento em Engenharia Agro-Industrial - Instituto Superior de AgronomiaListeria monocytogenes is a foodborne, psychrotolerant and intracellular pathogenic bacterium responsible for listeriosis, a serious infectious disease in humans and animals. With the purpose to better enlighten the risk of the consumption of food contaminated with these bacteria, 168 isolates from food, humans, animal and from environmental sources were analysed. The molecular characterization of the isolates included serogrouping by Multiplex PCR (MPCR), Random Amplified Polymorfic DNA (RAPD) and Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) analysis. The evaluation of virulence of the strains was assessed with plaque-forming assay in HT-29 cell monolayers. Among 74 food isolates, MPCR group 4 (4b-4d-4e) was the most prevalent (41.9 %). The obtained results confirmed the higher discriminatory power of PFGE (SID = 0.97) in comparison with the RAPD technique (SID = 0.85). The query in Pathogen Tracker 2.0 of PFGE patterns allowed the identification of universally disseminated and potentially dangerous clones. After exposing the strains to refrigeration (7 ºC) and freezing (-20 ºC e -80 ºC) temperatures, the virulence of the strains is significantly decreased (P < 0.05) after refrigeration under starvation. The analysis performed in this work suggests that food related isolates are potentially pathogenic and stresses out the risk of listeriosis after consumption of food contaminated with L. monocytogenes-----------------------------Listeria monocytogenes é uma bactéria patogénica intracelular, de origem alimentar, psicrotolerante, responsável pela listeriose, uma doença infecciosa grave, em humanos e animais. Com o objectivo de melhor esclarecer o risco associado ao consumo de alimentos contaminados com esta bactéria, foram analisados neste trabalho 168 isolados de L. monocytogenes de origem alimentar, clínica, animal e ambiental. A caracterização molecular dos isolados incluiu a análise por Multiplex PCR (MPCR), amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD) e a electroforese em campo pulsado (PFGE). A avaliação da virulência das estirpes foi feita através de ensaios de formação de placas de lise (PFA) em monocamadas da linha celular animal HT-29. Em 74 isolados de origem alimentar, o grupo MPCR 4 (4b-4d-4e) foi o mais prevalente (41,9 %). Os resultados obtidos confirmam o elevado poder discriminatório da técnica PFGE (SID = 0,97) comparativamente à técnica RAPD (SID = 0,85). A comparação dos perfis de PFGE na base de dados Pathogen Tracker 2.0, permitiu a identificação de clones universalmente disseminados e potencialmente perigosos. Os resultados obtidos após sujeição das estirpes às temperaturas de refrigeração (7 ºC) e de congelação (-20 ºC e -80 ºC) sugerem um abaixamento significativo (P < 0,05) da virulência, após refrigeração dos isolados, na ausência de crescimento. As análises efectuadas neste trabalho sugerem que os isolados alimentares ou relacionados com o ambiente alimentar são potencialmente patogénicos e enfatizam o risco de listeriose associado ao consumo de alimentos contaminados com L. monocytogenes