Fertilização In Vitro heteróloga utilizando ovócitos de bovino e sémen de garanhão

Dissertação de Mestrado em Engenharia Zootécnica.A técnica de Fertilização In Vitro (FIV) pode ser utilizada para determinar o potencial de fertilização de sémen uma vez que permite identificar e avaliar as características seminais e observar a ligação e penetração da zona pélucida por parte dos espermatozóides (Spz). No caso de espécies em vias de extinção ou que não sejam utilizadas para consumo tornando-se difícil o acesso aos gâmetas femininos para se proceder à técnica da FIV, recorre-se à técnica da FIV heteróloga. Esta técnica consiste na utilização de gâmetas femininos de uma espécie diferentes da dos gâmetas masculinos e permite-nos avaliar a motilidade, a reacção acrossómica, a penetração no ovócito, a descondensação do DNA e formação de pró–núcleos. Desta forma, este estudo foi efectuado para determinar a capacidade fecundante de dois garanhões utilizando sémen fresco e congelado, recorrendo à técnica de fertilização in vitro heteróloga, utilizando ovócitos bovinos desprovidos de zona pelúcida. A recolha de sémen foi efectuada com uma vagina artificial, modelo Hannover. Após a recolha foram efectuadas avaliações macroscópicas e microscópicas ao sémen: volume, motilidade total, motilidade progressiva e o teste hiposmótico (HosT) e concentração espermática. Após a congelação/descongelação do sémen foram efectuadas avaliações microscópicas. A avaliação da integridade da membrana acrossómica e da membrana plasmática foi efectuada através da técnica de citometria de fluxo, utilizando fluorocromos SYBR-14 e propidium iodide (PI) e fluorescein isothiocyanate conjugated with Peanut Agglutinin (FITC-PNA) respectivamente. Na técnica de fertilização in vitro heteróloga utilizou-se um total de 373 ovócitos co-incubados com sémen fresco e congelado de dois garanhões. Após 18 horas de co-incubação os ovócitos foram fixados numa solução de etanol: ácido acético (3:1, v/v) e corados com 4’,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI). Os ovócitos que apresentaram cabeças de espermatozóides descondensadas ou formação de pró- núcleos foram considerados fertilizados. No que concerne aos resultados da avaliação macroscópica o ejaculado do garanhão A registou um volume de sémen livre de gel de 52,5 ± 2.5 ml e o garanhão B de 22,5 ± 3,2 ml. Na avaliação microscópica, no que concerne à motilidade total do dos espermatozóides, com sémen fresco, o garanhão A apresentou valores de 52,5 ± 4.8% de espermatozóides e o garanhão B de 40 ± 4,1% e com sémen congelado/descongelado o garanhão A apresentou valores de 51,7 ± 1,7% e o garanhão B de 10,7 ± 0,7% de Spz. Quanto à motilidade progressiva, nas amostras de sémen fresco o garanhão A apresentou valores de 40 ± 7,1% Spz e o garanhão B de 27,5 ±2,5% Spz, nas amostras de sémen congelado o garanhão A registou valores de 43,3 ±1,7% de Spz e o garanhão B de 7 ± 0,6% de Spz. Quanto aos valores do teste HosT, nas amostras de sémen fresco o garanhão A apresentou valores de 61 ± 5,2% Spz e o garanhão B de 47,5 ± 11,3% Spz, nas amostras de sémen congelado o garanhão A apresentou valores médios de 48,7 ± 2,9% Spz e o garanhão B de 18,7 ± 2,7% Spz. Relativamente à concentração espermática dos ejaculados, o garanhão A apresentou valores de 199 x 106 ± 33,6 x 106 Spz/ml e o garanhão B 168 x 106 ± 53 x 106 Spz/ml. No que diz respeito aos resultados da técnica de citometria de fluxo, o garanhão A apresentou valores estatisticamente diferentes (P ≤ 0,05) para o sémen fresco e congelado, quando comparado com o garanhão B. Desta forma, na avaliação da integridade da membrana acrossómica o sémen fresco apresentou valores de 91,04 ± 0,7% e o sémen congelado de 76,4 ± 7,79%. O garanhão B apresentou valores de 27.44 ± 2.59 no sémen fresco e de 25.92 ± 2.97% no sémen congelado. No que diz respeito à integridade da membrana plasmática o garanhão A registou valores, no sémen fresco, de 83.6 ± 1.55% e no sémen congelado de 57.69 ± 9.01%. O garanhão B apresentou valores de sémen fresco e sémen congelado de 16.57 ± 3.17% versus 6.87 ± 1.05%, respectivamente. Os resultados da fertilização in vitro heteróloga demonstraram diferenças significativas (P ≤0,05) entre os dois garanhões no que diz respeito à capacidade fecundante. Assim, o garanhão A registou taxas de fertilização com sémen fresco de 51,9 ± 2,25% e com sémen congelado de 34,41 ± 2,7% tendo o garanhão B, com sémen fresco registado valores de fertilização de 48,1 ± 6,95% e com sémen congelado de 13,7 ± 1,6%. Com a realização deste estudo pode-se inferir que a FIV heteróloga pode ser uma técnica alternativa para identificar as diferenças seminais entre machos, podendo servir como ferramenta para prever o potencial de fertilidade do sémen de garanhões.ABSTRACT: The technique of in vitro fertilization (IVF) can be used to determine the potential fertility of semen as it allows identifying and assessing the seminal characteristics observing binding and penetration of the zona pellucida by the sperm. In the case of endangered species or species that are not used for food consumption it is difficult to have access to female gametes to make the technique of IVF so we use the technique of heterologous IVF. In this technique female gametes of a different kind of male gametes are used, allowing assess the motility, acrosome reaction, penetration into the oocyte, decondensation of DNA and formation of pronuclei. The present study was designed to evaluate the interaction between fresh/frozen-thawed stallion spermatozoa and zona pellucida (ZP) free bovine oocytes using heterologous fertilization. Semen was collected from two stallions (A and B) by an artificial vagina, Hannover model. After collecting macroscopic and microscopic semen evaluation has been performed: volume, total motility, progressive motility and hypoosmotic test (HosT) and sperm concentration. Evaluations were also performed after thawing. The assessment of membrane integrity and acrosome and plasma membranes was performed by flow cytometry technique, using SYBR-14, propidium iodide (PI) and fluorescein isothiocyanates conjugated with Peanut Agglutinin (FITC-PNA). For the heterologous IVF a total of 373 oocytes were co-incubated with fresh and frozen/thawed semen of the two stallions. After 18 hours co-incubation of the oocytes were fixed in a solution of ethanol: acetic acid (3:1, v/v) and stained with 4 ', 6 - diamidino-2-phenylindole (DAPI). Oocytes presented decondensed sperm heads or formation of two polar bodies were considered as fertilized. Results of macroscopic evaluation of the gel-free semen was 52.5 ± 2.5 ml for stallion A and 22.5 ± 3.2 ml for stallion B. Concerning fresh sperm motility, results were 52.5 ± 4.8% and 40 ± 4.1% respectively for stallion A and B, being 51.7 ± 1.7% and 10.7 ± 0.7% respectively for the stallion A and B in thawed sperm. For progressive motility stallion A and B were respectively 40 ± 7.1% and 27.5 ± 2.5%for fresh sperm, being 43, 3 ± 1.7% and 7 ± 0.6% for thawed sperm. HosT test represented 61 ± 5.2% and 47.5 ± 11.3%, respectively for stallion A and B in fresh sperm and 48.7 ± 2.9% and 18.7 ± 2.7% for thawed sperm. Stallion A presented a concentration of 199 x 106 ± 33.6 x 106 Spz / ml and the stallion B 168 x 10 6 ± 53 x 106 Spz / ml. By flow cytometry, it has been observed that fresh and frozen-thawed semen of the stallion A represented better results for the acrosome integrity (91.04 ± 0.7 % versus 76.4 ± 7.79%, respectively) than the observed for the Stallion B (27.44 ± 2.59 % versus 25.92 ± 2.97%, respectively) (P<0.05). Stallion A presented 83.6 ± 1.55% and 57.69 ± 9.01% respectively for fresh and thawed sperm for membrane integrity, while only 16.57 ± 3.17% and 6.87 ± 1.05% of the sperm, represented membrane integrity for stallion B. Results of fertilization demonstrated statistical differences (P