Structural and functional dynamic effects of polyamines in both the photodevelepoment and photoadaptation of the photosynthetic apparatus

Photosynthesis comprises nowadays a wide and most active research field. This incomparable plant process constitutes not only the primary basis for sustaining plant life, but also a primary source for supporting life earth wide, since it comprises the only pathway for introducing the sunlight energy needed to the living organisms for biomass production. The processes of chloroplast photodevelopment, and photoadaptation of the photosynthetic apparatus are considered to be most important for the structural and functional integrity of the photosynthetic performance. The chloroplast photodevelopment is a dynamic process triggering the building of the photosynthetic apparatus and thus the basis for photosynthesis, whereas photoadaptation permits the fine tuning of the stucture and function of the developed photosynthetic apparatus, by both exploiting the environmental conditions the best way, and at the same time being able to protect itself from any putative harmfull environmental conditions. The three main polyamines (Put, Spd, Spm) were found to be localized in the chloroplast, whereas most importantly they were found to be attached to photosynthetic subcomplexes [Kotzabasis et al., 1993; del Duca et al., 1994]. Furthermore, their role in the chloroplast was associated with drastic prosseces, such as the stabilization of chlorophyll protein complexes [Besford et al., 1993] and the inhibition of the light-independent chlorophyll biosynthesis [Beigbeder and Kotzabasis, 1994]. Thus, the present dissertation aimed to the dissection of the role of polyamines in the dynamic processes of the photodevelopment and photoadaptation of the photosynthetic apparatus. For the purpose of the experimentation the wild type strain of the unicellular green alga (Chlorophycae) Scenedesmus obliquus was used and also its mutant strains C-2A- and C-6D, since the three strains comprise different levels of the chloroplast developmental stage. The results showed that polyamines, and especially Put are readily being regulated by onset of light and this process promotes the gradual decline of both their intracellular and intraplastidal concentrations, beginning with an oscillatory pattern. The primary photoreceptor for this regulation was identified as the -active- Protochlorophyllide, which also comprises the primary photoreceptor for chlorophyll biosynthesis and chloroplast photodevelopment. Thus, polyamine regulation and chloroplast photodevelopment share the shame photoreceptor. Other components of the signaling pathway leading to the polyamine regulation by light are heterotrimeric G-proteins, cyclic nucleotides (cNMPs), protein kinases protein phosphatases, calmodulin and Ca2+. The studied pathway reveals similarity to the pathway leading to the photosynthetic gene expression. Thus, polyamines seem to play a central role in the pathway which coordinates the chlorophyll and appoprotein biosynthesis, for the concerted development of the photosynthetic constituents. In parallel, whereas the development of the photosynthetic apparatus is still ongoing, the newly assembled Photosystem II subcomplexes trigger a second regulation of polyamine levels, by means of increasing their bound levels to the major antenna complex of PSII, the LHCII. LHCII has a unique role in photoadaptation processes, by readily adjusting its size, as a response to the changing light intensities. By externally manipulating the polyamine levels, an indisputable relation was found between the LHCII size and polyamine levels: low Put or increased Spm levels promote increase in the LHCII size, simulating low light conditions, whereas, increased Put concentration produces a smaller LHCII antenna size, an effect normally seen in high light conditions. Further dissection on the effect of polyamines in the polymerization/apopolymerization of LHCII, showed that Put and Spm affect the autoproteolytic properties of LHCII, thus modifying its size independently of the environmental light conditions. Other studies performed in the laboratory of Plant Biochemistry and Photobiology (Univ. of Crete, dep. Biology) revealed the participation of the LHCII size regulation in plant photosynthetic responses to many different environmental stressors, such as high ozon concentration [Navakoudis et al., 2003] (study performed with the contribution of the GSF-Research Center (Munich), UVB radiation [Navakoudis et al., in preparation; Sfichi et al., 2004], high CO2 [Logothetis et al., 2004). In all these cases, externally manipulated polyamine concentrations were effective in reversing the sensitivity of the photosynthetic apparatus to the stressor. Thus, polyamines play a major role in regulating the LHCII size status and concomitantly the photosynthetic efficiency, thus increasing plant production under unfavourable environmental conditions.Η φωτοσύνθεση και οι επιμέρους λειτουργίες στις οποίες συνίσταται, αποτελούν ένα ευρύ και διαρκώς ανοιχτό ερευνητικό πεδίο. Η τόσο σημαντική αυτή λειτουργία για τη διαβίωση των φυτών, συγκεντρώνει το ερευνητικό ενδιαφέρον, διότι σ΄ αυτή στηρίζεται, είτε άμεσα είτε έμμεσα, η διατήρηση της ζωής στον πλανήτη, αφού μέσω της φωτοσύνθεσης επιτυγχάνεται η είσοδος της ηλιακής ενέργειας στη ζώσα ύλη για την παραγωγή βιομάζας. Ιδιαίτερα σημαντικές για τη λειτουργία της φωτοσύνθεσης είναι, αφ' ενός η ικανότητα της ανάπτυξης του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, στη δομική και λειτουργική οργάνωση του οποίου στηρίζεται η ίδια η φωτοσύνθεση, και αφ' ετέρου η ικανότητα της προσαρμογής του στις διαρκώς μεταβαλλόμενες συνθήκες του περιβάλλοντος (βραχυπρόθεσμες και μακροπρόθεσμες), έτσι ώστε να επιτυγχάνεται τόσο η βέλτιστη εκμετάλλευση των περιβαλλοντικών συνθηκών προς όφελος της φωτοσύνθεσης, αλλά και η προστασία του ίδιου του φωτοσυνθετικού μηχανισμού και ως εκ τούτου η εξασφάλιση της εύρυθμης λειτουργίας του. Οι δύο αυτές επιμέρους διαδικασίες, η φωτοανάπτυξη και η φωτοπροσαρμογή του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, αποτέλεσαν αντικείμενο της παρούσας ερευνητικής εργασίας. Με δεδομένη της ύπαρξη των τριών κύριων πολυαμινών (Put, Spd, Spm) στον χλωροπλάστη, και μάλιστα τη σύνδεσή τους με υποσύμπλοκα του φωτοσυνθετικού μηχανισμού [Kotzabasis et al., 1993; Del Duca et al.,1994], αλλά και τις διαρκώς αυξανόμενες ενδείξεις για την ανάληψη δραστικότατων ρόλων από τις πολυαμίνες στη διατήρηση/τροποποίηση ζωτικών για το φωτοσυνθετικό μηχανισμό λειτουργιών (σταθεροποίηση πρωτεϊνών και χλωροφυλλών [Besford et al., 1993], αναστολή της φωτοανεξάρτητης μετατροπής του πρωτοχλωροφυλλιδίου [Beigbeder and Kotzabasis, 1994]), η παρούσα μελέτη εστιάστηκε στην αποσαφήνιση του ρόλου των πολυαμινών στις διαδικασίες της φωτοανάπτυξης του χλωροπλάστη και της φωτοπροσαρμογής του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Για τους σκοπούς της μελέτης χρησιμοποιήθηκε ο άγριος τύπος του μονοκύτταρου χλωροφύκους Scenedesmus obliquus, καθώς και τα μεταλλαγμένα στελέχη αυτού, C-2A- και C-6D, που από κοινού συνιστούν μια κλιμακούμενη διαφοροποίηση στο αναπτυξιακό στάδιο του χλωροπλάστη. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως τo πρότυπο των ποιοτικών και ποσοτικών μεταβολών των πολυαμινών, και ειδικότερα της Put, που επάγονται, τόσο σε κυτταρικό, όσο και σε πλαστιδιακό επίπεδο, στο φως, κατά τη διαδικασία σχηματισμού του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, εμφανίζει μια ταλαντωτική πτώση, η οποία σηματοδοτείται από τον ίδιο φωτοϋποδοχέα (ενεργό πρωτοχλωροφυλλίδιο) που ρυθμίζει τη βιοσύνθεση των χλωροφυλλών και κατ' επέκταση τη φωτοανάπτυξη του χλωροπλάστη. Η διερεύνηση της διαδικασίας φωτορύθμισης των πολυαμινών συνεχίστηκε με τη διαλεύκανση του μονοπατιού μεταβίβασης του σήματος, που ξεκινά από τον φωτοϋποδοχέα και καταλήγει να ρυθμίσει τα επίπεδα των πολυαμινών στον χλωροπλάστη, αλλά και σε ολόκληρο το κύτταρο. Οι μελέτες αυτές, ενέδειξαν τη συμμετοχή ετεροτριμερών G-πρωτεϊνών, κυκλικών νουκλεοτιδίων, κινασών, φωσφατασών, καλμοδουλίνης και ασβεστίου, στο εν λόγω σηματοδοτικό μονοπάτι, το οποίο φάνηκε να έχει πολλές ομοιότητες με τα σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν τη βιοσύνθεση των αποπρωτεϊνών του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Έτσι, η ρύθμιση του επιπέδου των πολυαμινών κατά τη φωτοανάπτυξη του χλωροπλάστη, όπως προτείνεται, αποτελεί ένα κομβικό σημείο στο συντονισμό της βιοσύνθεσης της χλωροφύλλης απ' τη μια και των αποπρωτεϊνών του φωτοσυνθετικού μηχανισμού απ' την άλλη, διαδικασία απαραίτητη για τη σωστή δομική και λειτουργική οργάνωση του φωτοσυνθετικού μηχανισμού. Παράλληλα, με την εμφάνιση των πρώτων υποσυμπλόκων του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, κατά τη φωτοανάπτυξη του χλωροπλάστη, όπως διαπιστώθηκε, σηματοδοτούνται νέες ρυθμίσεις στα επίπεδα των πολυαμινών, αυτή τη φορά από το κέντρο αντίδρασης του φωτοσυστήματος ΙΙ, που έχουν σαν στόχο την φωτοπροσαρμογή του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, με μια διαδικασία στην οποία εμπλέκονται δραστικά οι πολυαμίνες και κυρίως η διαμίνη Put και η τετραμίνη Spm. Ρόλο - κλειδί στην φωτοπροσαρμοστική ικανότητα του φωτοσυνθετικού μηχανισμού παίζει το κύριο φωτοσυλλεκτικό σύμπλοκο του φωτοσυστήματος ΙΙ, το LHCII, το οποίο έχει τη δυνατότητα να αυξομειώνει το μέγεθός του, ανάλογα με τις συνθήκες του φωτονιακού περιβάλλοντος (ένταση φωτισμού). Αύξηση λοιπόν της Put ή μείωση της Spm βρέθηκε να μειώνει σημαντικά το μέγεθος του LHCII, προσομοιώνοντας συνθήκες υψηλής έντασης φωτισμού, ενώ αντίστροφα, μείωση της Put αυξάνει σημαντικά το μέγεθος του LHCII, προσομοιώνοντας συνθήκες χαμηλής φωτονιακής ροής. Οι επιδράσεις αυτές των πολυαμινών και κυρίως της Put, στο λειτουργικό μέγεθος της φωτοσυλλεκτικής κεραίας LHCII, σχετίζονται άμεσα με την αυτοπρωτεολυτική ενεργότητα του συμπλόκου, ρυθμίζοντας έτσι το επίπεδο πολυμερισμού/αποπολυμερισμού του LHCII και κατ' επέκταση τη φωτοπροσαρμογή του φωτοσυνθετικού μηχανισμού, ανεξάρτητα από το φωτονιακό περιβάλλον. Παράλληλες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί (σε συνεργασία με το Ινστιτούτο GSF του Μονάχου) ή πραγματοποιούνται στο εργαστήριο Βιοχημείας Φυτών και Φωτοβιολογίας, αποδεικνύουν την άμεση σχέση της ρύθμισης της φωτοσυλλεκτικής ικανότητας του LHCII, μέσω των πολυαμινών, με τη φωτοσυνθετική απόκριση των φυτών σε διάφορες περιβαλλοντικές καταπονήσεις (όζον [Navakoudis et al., 2003], UVB [L?tz et al., υπό προετοιμασία; Sfichi et al., 2004], CO2 [Logothetis et al., 2004), και επομένως αφήνουν να διαφαίνεται η δυνατότητα εξωγενούς χειρισμού της ευαισθησίας /ανθεκτικότητας των φυτών στις καταπονήσεις αυτές, με στόχο τη βελτίωση της φωτοσυνθετικής τους απόδοσης και κατ' επέκτασης της φυτικής παραγωγής