High resolution physical mapping of human chromosomal region 10q23 and contribution to the fuctional analysis of Neuralized gene

This thesis consists of two parts. In the first, we describe the construction of a high resolution, sequence-ready physical map of the gene-rich q23.31-q23.33 region of human chromosome 10 and evaluate the information derived from the in silico analysis of the corresponding DNA sequence. In the second part, we present our work on structural, evolutionary and functional characteristics of the murine Neuralized ( Νeurl ) gene, the human NEURL ortholog located adjacently to the above region. By using as probes 36 STSs (Sequence Tag Sites) mapped to 10q23.31-q23.33, we isolated 22 PAC and 316 BAC chromosomal clones and proceeded to their structural analysis by means of comparative DNA fingerprinting. Our data led to the construction of a well-supported, sequence-ready unique contig of about 4.38 Mb delimited by the microsatellite markers D10S541 and D10S583, located proximal and distal to the centromere, respectively. The contig was used by the collaborating laboratory of Sanger Center, for the selection of a tiling path of 35 BACs, which were then employed in DNA sequence determination. The corresponding finished DNA sequence is without gaps and, as revealed by extensive in silico analysis, contains 51 genes, 35 of which are of unknown function. However, 11 of the latter encode polypeptides with distinctive domains present in proteins of known function. Recent studies from a number of groups including ours, have suggested that the drosophila neuralized (neur) participates in Notch signaling and that the mouse ortholog, Neurl, may play a regulatory role in various cellular functions. In order to further characterize Neurl , we isolated 17 phage clones from a mouse strain 129SV genomic library and determined the chromosomal organization of the gene. In combination with information from various databases, our experimental data suggested that Neurl spans 79 Kb of genomic DNA, consists of 7 exons and appears to be under the control of two distinct, alternatively used promoters, one of which is located in the 47.3 Kb long, intron 1. The gene encodes two Neurl polypeptides, 574 and 557 aa long, differing at their amino-terminus, as a result of the alternative use of exon 1 and the downstream exon 1a. Extensive comparative analysis at the nucleotide level suggested that the chromosomal organization of the gene is quite similar in insects and mammals and demonstrated possible Νeurl regulatory elements in mammals. Moreover, systematic protein sequence comparisons among neuralized orthologs from several organisms, i.e.: C. elegans D. melanogaster, A. gambiae, F. rubripes, D. rerio, X. laevis, R. norvegicus, revealed that the neuralized protein family is well-conserved in multicellular animal species from the worm and insects to mammals, prominently at the characteristic NEUZ 1, 2 and RING domains. In particular, NEUZ1 represents the most conserved domain among vertebrates whereas the RING is the most conserved domain between vertebrate and invertebrate species. The latter, possibly suggests similar biochemical function of the protein in all species and demonstrates the central role of the RING domain. In order to further elucidate the biological role of Neurl, we employed the yeast two-hybrid system to identify proteins that directly interact with it. The screening resulted in the identification of 9 proteins known to participate in significant cell functions, i.e: motor-based intracellular transport, cell movement or stability (Dlc-1, Gas8, Evpl and ankycorbin), cell division or apoptosis (Numa1, Lek1, Dlc-1, Peg3), posttranslational protein modification (Ubc9) and transcriptional regulation (Dnmt3a). Protein interactions were further verified by in vitro and cell culture experiments, using GST pull-downs and co-immunoprecipitation (co-IP) assays, respectively. Supporting evidence for these interactions, also, derived from: i. Demonstrating overlapping expression patterns of the corresponding genes in mouse embryo sections, using comparative RNA in situ hybridization, and ii. detecting subcellular co-localization of the respective endogenous and/or transiently expressed recombinant proteins, using confocal microscopy. As shown by co-IP assays where a number of complimentarily truncated polypeptides were employed, Neurl-protein interactions are in general mediated by NEUZ1 and NEUZ2. However, a number of differencess exist. NEUZ1 is absolutely necessary and sufficient for binding with Dlc-1 and Gas8 but not with Ubc9, whereas the RING domain is required for adequate Neurl binding with Ubc9. In accordance to the general notion about RING containing proteins, our results suggest that Neurl may function as an adaptor molecule bringing, selectively, together various proteins and thus, participating as an essential component, in multi-protein cellular complexes. Accordingly, its interaction with Dlc-1 may explain the axonemal defects manifested in Neurl -/- male mice. In addition, its interaction with Ubc9 may imply either its post-translational modification by SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) or its role as a SUMO E3 ligase. Interestingly, several of the Neurl interactors display appropriate sites for sumoylation and thus could be considered as candidate substrates. In fact one of them, Dnmt3a, is already known to be subjected in sumoylation. Conclusively, we believe that the identification of Neurl interacting proteins is fundamental towards the elucidation of its biological role and motivates the design of a long series of interesting in vitro and in vivo experiments for its further functional analysis.H παρούσα διατριβή αποτελείται από δύο μέρη. Στο πρώτο, περιγράφουμε την κατασκευή ενός υψηλής ευκρίνειας φυσικού χάρτη με στόχο την αλληλούχηση της πλούσιας σε γονίδια περιοχής q23.31-q23.33 του χρωμοσώματος 10 του ανθρώπου και αξιοποιούμε την πληροφορία που προκύπτει από την in silico ανάλυση της αντίστοιχης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στο δεύτερο, παρουσιάζουμε τη μελέτη δομικών, εξελικτικών και λειτουργικών χαρακτηριστικών του γονιδίου Νeuralized (Neurl) του ποντικού, ορθόλογου του ανθρώπινου ΝΕURL, που χαρτογραφείται πλησίον της παραπάνω χρωμοσωμικής περιοχής. Χρησιμοποιώντας ως ανιχνευτές 36 STSs (Sequence Tag Sites), που χαρτογραφούνται στην περιοχή 10q23.31-q23.33, απομονώσαμε 22 και 316 χρωμοσωμικούς κλώνους PAC και BAC, αντίστοιχα. Ο δομικός χαρακτηρισμός των κλώνων έγινε με σύγκριση του προτύπου τεμαχισμού τους με διάφορα περιοριστικά ένζυμα και έτσι δημιουργήθηκε ένα ενιαίο, ιδιαίτερα αξιόπιστο contig κλώνων μήκους 4.38 Mb, που ορίζεται από τους μικροδορυφορικούς γενετικούς δείκτες D10S451 και D10S583, που τοποθετούνται εγγύς και άπω του κεντρομερούς, αντίστοιχα. Με βάση αυτό το contig, επιλέχθηκαν από το συνεργαζόμενο εργαστήριο του Sanger Center 35 κλώνοι BAC, οι οποίοι διατρέχουν τη συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή και έχουν τη μικρότερη δυνατή επικάλυψη. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία που προέκυψε από την ανάλυση αυτών των κλώνων είναι ενιαία καθ όλο το μήκος του contig. Όπως προσδιορίστηκε μετά από συστηματική ανάλυση in silico, η περιοχή που περικλείεται από τους ανωτέρω δείκτες περιέχει 51 γονίδια, 35 από τα οποία είναι άγνωστης λειτουργίας. Από τα τελευταία, 11 κωδικοποιούν πολυπεπτίδια που φέρουν χαρακτηριστικές περιοχές ομολογίας με πρωτεΐνες γνωστής λειτουργίας. Πρόσφατες αναφορές μιας σειράς ερευνητικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένης και της δικής μας, έχουν προτείνει ότι η πρωτεΐνη neuralized της δροσόφιλας συμμετέχει στη σηματοδότηση Notch και ότι η ορθόλογη πρωτεΐνη Neurl του ποντικού πιθανόν να έχει ρυθμιστικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Με σκοπό τoν περαιτέρω χαρακτηρισμό του Neurl, απομονώσαμε 17 κλώνους βακτηριοφάγου από μια γονιδιωματική βιβλιοθήκη ποντικού (στέλεχος 129SV) και προσδιορίσαμε τη χρωμοσωμική οργάνωση του γονιδίου. Με βάση τα πειραματικά μας αποτελέσματα σε συνδυασμό με πληροφορίες από διάφορες βάσεις δεδομένων, το γονίδιο εκτείνεται σε 79 Kb χρωμοσωμικής αλληλουχίας, αποτελείται από 7 εξόνια και φαίνεται ότι ελέγχεται από δύο διαφορετικούς, εναλλακτικά χρησιμοποιούμενους υποκινητές, ο ένας από τους οποίους βρίσκεται εντός του πρώτου ιντρονίου, μήκους 47.3Κb. To γονίδιο κωδικοποιεί δύο πολυπεπτίδια Neurl, μήκους 574 και 557 αμινοξέων, που διαφέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο, λόγω της χρήσης των εξονίων 1 και 1α από τους δύο εναλλακτικούς υποκινητές. Λεπτομερής συγκριτική ανάλυση στο νουκλεοτιδικό επίπεδο έδειξε ότι η χρωμοσωμική οργάνωση του γονιδίου είναι παρόμοια στα έντομα και στα θηλαστικά και επισήμανε πιθανά ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου των θηλαστικών. Αντίστοιχα, από τη συστηματική σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας των ορθόλογων πρωτεϊνών μιας σειράς οργανισμών (C. elegans, D. melanogaster, A. gambiae, F. rubripes, D. rerio, X. Laevis, R. norvegicus) αποκαλύφθηκε ότι η οικογένεια των πρωτεϊνών neuralized είναι αρκετά συντηρημένη στους ζωικούς οργανισμούς από τον νηματώδη και τα έντομα έως τα θηλαστικά, εμφανίζοντας υψηλότερη συντήρηση στις χαρακτηριστικές περιοχές NEUZ1, 2 και RING. Συγκεκριμένα, το NEUZ1 είναι η πιο συντηρημένη περιοχή του Neurl στα σπονδυλωτά, ενώ το RING είναι η πιο συντηρημένη περιοχή μεταξύ σπονδυλωτών και ασπόνδυλων. Το τελευταίο, πιθανόν, υποδηλώνει την καθοριστική σημασία του RING στη λειτουργία της πρωτεΐνης και τον παρόμοιo βιοχημικό ρόλο του neuralized μεταξύ των ειδών. Με στόχο την περαιτέρω διαλεύκανση του βιολογικού ρόλου του Neurl, χρησιμοποιήσαμε το σύστημα δύο υβριδίων του σακχαρομύκητα για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν άμεσα με αυτό. Η διερεύνηση απέδωσε εννέα λιγότερο ή περισσότερο καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες, που συμμετέχουν σε σημαντικές λειτουργίες του κυττάρου, ήτοι στην ενδοκυττάρια κίνηση μέσω πρωτεϊνών - κινητήρων, στην κίνηση ή σταθερότητα του κυττάρου (Dlc-1, Gas8, Evpl και Αnkycorbin), στην κυτταρική διαίρεση ή απόπτωση (Numa1, Lek1, Dlc-1, Peg3), σε μετα- μεταφραστικές τροποποιήσεις πρωτεϊνών (Ubc9) και στη μεταγραφική ρύθμιση (Dnmt3a). Οι αλληλεπιδράσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με δοκιμές πρωτεϊνικής αλληλεπίδρασης in vitro και μετά από παροδική συνέκφραση σε κύτταρα θηλαστικών, εφαρμόζοντας τις μεθόδους GST-pull-down και συν-ανοσοκατακρήμνισης (co-IP), αντίστοιχα. Πρόσθετες ενδείξεις που υποστηρίζουν αυτές τις αλληλεπιδράσεις προέκυψαν από: i. τον προσδιορισμό των επικαλύψεων στο πρότυπο έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων, με πειράματα υβριδοποίησης RNA in situ σε τομές εμβρύων ποντικού, και ii. την ανίχνευση του υποκυτταρικού συνεντοπισμού των ενδογενών ή/και παροδικά εκφραζόμενων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, με παρατήρηση σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Όπως έδειξαν πειράματα co-IP, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν αλληλοσυμπληρούμενα ελλεμματικά πολυπεπτίδια Neurl, oι αλληλεπιδράσεις του με τις άλλες πρωτεΐνες επιτυγχάνονται γενικά, μέσω των περιοχών NEUZ1 και ΝΕUZ2, με ορισμένες όμως, διαφοροποιήσεις. Συγκεκριμένα, το NEUZ1 είναι απόλυτα αναγκαίο και ικανό για την αλληλεπίδραση του Neurl με τις πρωτεΐνες Dlc-1 και Gas8 αλλά όχι με την Ubc9, ενώ το RING είναι απαραίτητο για τη βέλτιστη πρόσδεση του Neurl στο Ubc9. Με βάση τα αποτελέσματά μας και σε συμφωνία με τον γενικό χαρακτηρισμό που αποδίδεται σε πρωτεΐνες που διαθέτουν περιοχή RING, προτείνουμε για το Neurl τον ρόλο του μεσολαβητή, δηλαδή ενός ενδιάμεσου μορίου που φέρνει επιλεκτικά σε επαφή διάφορες πρωτεΐνες μεταξύ τους, συμμετέχοντας με αυτόν τον τρόπο σε λειτουργικά πολυ-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Έτσι, η αλληλεπίδρασή του με την Dlc-1 πιθανόν να εξηγεί τη αποδιοργανωμένη δομή του αξονήματος στα σπερματοζωάρια των αρσενικών ποντικών Neurl -/-. Επιπλέον, η αλληλεπίδρασή του με το Ubc9 είναι πιθανόν να υποδηλώνει είτε τη μετα-μεταφραστική τροποποίησή του Neurl με το πεπτίδιο SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), ή τον ρόλο του ως λιγάση Ε3 σε διαδικασίες SUMOλίωσης άλλων πρωτεϊνών. Αξίζει να σημειωθεί ότι αρκετές από τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το Neurl εμφανίζουν κατάλληλες θέσεις για SUMOλίωσης και θα μπορούσαν να θεωρηθούν ως υποψήφια υποστρώματα. Πράγματι, για μία από αυτές, την Dnmt3a, έχει ήδη επιβεβαιωθεί η τροποποίησή της με SUMO. Συμπερασματικά, θεωρούμε ότι η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το Neurl, έχει θεμελιώδη σημασία για την αποσαφήνιση του βιολογικού του ρόλου και αποτελεί τη βάση για τον σχεδιασμό μιας μακράς σειράς σημαντικών in vitro και in vivo πειραμάτων για την περαιτέρω λειτουργική ανάλυση της πρωτεΐνης