Crioconservación de semillas y protocormos de especies de la familia Orchidaceae en peligro de extinción

Proyecto de Investigación Instituto Tecnológico de Costa Rica. Vicerrectoría de Investigación y Extensión (VIE). Escuela de Biología. Centro de Investigación en Biotecnología (CIB), 2013Con el objetivo de establecer un protocolo de crioconservación de semillas y estructuras vegetativas de orquídeas, se seleccionaron varias especies mesoamericanas de las cuales se tomaron, como explantes iniciales, semillas de cápsulas cerradas y abiertas, así como protocormos y ápices meristemáticos obtenidos de vitroplantas. Para determinar la viabilidad de las semillas se utilizó el método con TTC al 0,6% publicado por Stempenkus y Lampheor (1967) y se aplicaron metodologías de desinfección superficiales, tanto de las cápsulas cerradas, por medio de etanol de 95% y flameo, como de las semillas obtenidas de frutos abiertos, haciendo uso de NaOCl al 0,5% i.a. por 8-10 minutos. Semillas de las especies de Guarianthe skninneri, Sobralia sp., Warscewiczella discolor, Lycaste tricolor y Epidendrum sp. fueron utilizadas para establecer la metodologías de crionconservación por medio de la técnica de vitrificación, en la cual los explantes se colocaron en una solución de carga por 20 minutos, seguido de la inmersión en PVS2 (por 40 o 60 minutos, dependiendo de la especie) para luego introducir en nitrógeno líquido. El descongelamiento se realizó por medio de Baño María a 40ºC por 60-90 segundos, seguido de al menos tres lavados con solución de lavado, cada uno con una duración de 3-5 minutos. De acuerdo con el análisis estadístico, la solución de carga puede omitirse en algunas especies y en otras puede favorecer la sobrevivencia. Utilizando las mismas especies, el protocolo de crioconservación de semillas utilizando soluciones saturadas de CaCl2 *2H2O y LiCl, consistió en exponer estas estructuras en un sistema cerrado con una atmósfera controlada de baja humedad provocado por dichas soluciones, por un periodo cercano a las 24 horas, luego de los cual fueron congeladas en nitrógeno líquido. El descongelamiento rápido se logró por medio de Baño María a 40ºC por 60 segundos y posteriormente se inocularon en medio de germinación. Este sistema representa una excelente y novedosa alternativa de crioconservación, ya que produjo mayores porcentajes de germinación que los obtenidos por la técnica de vitrificación, además de ser una metodología fácil de seguir, accesible, rápida de ejecutar y de bajo costo. La técnica de vitrificación en protocormos de 1-2 mm de diámetro, no resultó efectiva para las especies evaluadas (Maxillaria sp. y Prostechea ochracea). Los pretratatmientos con medios y soluciones de precultivo con altas concentraciones de sacarosa, el uso de solución de carga y PVS2 no fueron suficientes para proteger a estos explantes de las condiciones del nitrógeno líquido. El tamaño y la estructura esférica de los protocormos probablemente limitaron el efecto de los agentes crioprotectores, evitando su sobrevivencia luego del congelamiento. Se utilizó la técnica de vitrificación en ápices meristemáticos de Trichocentrum cebolleta. A pesar de que los resultados no fueron estadísticamente significativos, sí se dio sobrevivencia en algunos de los casos en los que se utilizó PVS2 solo o combinado con la aplicación de 3 previa de una solución de carga, representando esto una posibilidad de establecer una metodología efectiva de crioconservación para explantes vegetativos de orquídeas