Aislamiento e identificación de endófitos y epífitos en hojas de café colectadas en dos zonas de Costa Rica y su posible empleo como biocontroladores de Mycena citricolor

Proyecto de Graduación (Bachillerato en Ingeniería en Biotecnología) Instituto Tecnológico de Costa Rica, Escuela de Biología, 2010.Se aisló microorganismos epífitos y endófitos a partir de muestras de hojas de plantas de café sintomáticas y asintomáticas de “Ojo de gallo” de la finca La Rosalia ubicada en San Juan Norte de Poás de Alajuela de Costa Rica, y de plantas de café sintomáticas y asintomáticas de “Crespera” de la finca Málaga ubicada en San Gabriel de Aserrí de San José de Costa Rica. Los epífitos se obtuvieron mediante lavado de las muestras en Buffer de Fosfato con agitación manual por tres minutos y plaqueo de diluciones (concentrada, 10-1 y 10-2) sobre medio PDA. Para los endófitos las muestras se desinfectaron superficialmente (alcohol al 70% 2 minutos, hipoclorito de sodio al 3,5% i.a 2 minutos y dos lavados con agua destilada autoclavada 1 minuto cada uno), se maceraron en solución de buffer PBS 1X y se plaqueó diluciones (concentrada, 10-1 y 10-2) sobre medio PDA. Las placas se incubaron a 21º C bajo condiciones de luz ambiental por 4 semanas durante las cuales se aisló y purificó los microorganismos. La identificación bacteriana se llevó a cabo mediante los sistemas BIOLOG® y VITEK®. Los aislamientos fúngicos se identificaron mediante la presencia de estructuras reproductivas. Las colecciones de microorganismos obtenidas se ensayaron para probar su potencial antagónico contra la cepa My1 de Mycena citricolor sobre medio PDA mediante cultivo dual en placa, incubando las placas a 21º C, bajo condiciones de luz ambiental por 15 días. En la finca con sintomatología de “Ojo de gallo” las bacterias epífitas más abundantes fueron Chryseobacterium sp. para muestras de plantas sintomáticas, y Bacillus amyloliquefaciens y Chryseobacterium sp para plantas asintomáticas, mientras que Bacillus amyloliquefaciens junto a Ralstonia sp., y Raoutella terrigena junto a Ralstonia sp. fueron las bacterias endófitas más representativas en plantas asintomáticas y sintomáticas respectivamente. Para la finca con sintomatología de “Crespera” las bacterias epífitas más frecuentes correspondieron a Enterobacter cloacae para plantas asintomáticas y a Ralstonia sp. y Enterobacter cloacae para muestras sintomáticas, mientras que solo se obtuvo bacterias endófitas a partir de plantas sintomáticas correspondiendo los aislados a Tsukamurella inchonensis y Staphylococcus sp. En ambas localidades los aislados fúngicos estuvieron representados por el género Cladosporium y una gran cantidad de hongos no esporulados. Las diferencias en la cantidad y diversidad de los aislados tanto epífitos como endófitos entre las dos zonas de muestreo evidencian la influencia de factores ambientales locales sobre las microfloras presentes en las hojas. De los 59 aislados (hongos, levaduras y bacterias) ensayados in vitro contra M.citricolor cepa My1 solo el de ID B10, correspondiente a una bacteria, presentó un efecto inhibitorio significativo del crecimiento de dicho hongo. El método de cultivo dual en placa y el período de incubación por 15 días resultaron efectivos para la observación de potencial antagónico de los aislados así como para el descarte de aislados con un efecto inhibitorio temporal. ______________________________________________________________ ABSTRACT Epiphytes and endophytes were isolated from leaves of symptomatic and asymptomatic “Coffee Leaf Spot” coffee plants from “La Rosalia” cultivated ground area located in San Juan Norte, Poás, Alajuela, Costa Rica, and from leaves of symptomatic and asymptomatic “Coffee Leaf Scorch” coffee plants from “Málaga” cultivated ground area located in San Gabriel, Aserrí, San José, Costa Rica. Epiphytes were isolated by washing the samples in Phosphate Buffer with manual shaking for 3 minutes and platting dilutions (concentrated, 10-1 and 10-2) on PDA medium. Endophytes isolation was carried out by superficial disinfection of the samples (alcohol 70% 2 minutes, Sodium hypochlorite 3, 5% i.a 2 minutes and two washes with autoclaved distilled water 1 minute each one), followed of maceration of the samples in PBS 1X Buffer and platting dilutions (concentrated, 10-1 and 10-2) on PDA medium. All the plates were incubated at 21º C under environmental light conditions by 4 weeks and the emerging microorganisms were isolated and purified. The BIOLOG® system and the VITEK® system were performed to bacteria’s identification. Fungi identity was determinate with reproduction structure guides. The microorganism’s collections obtained were assayed for their antagonistic potential against Mycena citricolor strain My1 on PDA medium by dual culture incubating the plates at 21º C, under environmental light conditions for 15 days. For the cultivated ground area affected by “Coffee Leaf Spot” the most frequent epiphytic bacteria for symptomatic plants was Chryseobacterium sp. and for asymptomatic plants were Bacillus amyloliquefaciens and Chryseobacterium sp., whereas Bacillus amyloliquefaciens and Ralstonia sp., and Raoutella terrigena and Ralstonia sp. were the most representative endophytic bacteria for asymptomatic and symptomatic plants respectively. In the case of the cultivated ground area affected by “Coffee Leaf Scorch” the most frequent epiphytic bacteria for asymptomatic plants was Enterobacter cloacae and for symptomatic plants were Ralstonia sp. and Enterobacter cloacae, whereas endophytic bacteria only could be isolated from symptomatic plants being represented by Tsukamurella inchonensis and Staphylococcus sp .isolates. For the two sampled locations the isolated fungi were represented by the genus Cladosporium and several no sporulating fungi. The differences in quantity and diversity of both epiphytic and endophytic isolates among the two sampled sites demonstrates the local environmental factor’s influence over the leaf microfloras. From the 59 isolates (fungi, yeast and bacteria) assayed under in vitro conditions against M.citricolor strain My1 only the isolate ID B10, corresponding to bacteria, showed a significant inhibitory effect over the fungi’s growth. The dual culture method and the 15 days incubation period showed effectiveness for observing antagonistic potential and for discarding isolates with temporal inhibitory effect