Etude de p76, une nouvelle protéine mannose-6-phosphate : caractérisations biochimiques, localisation lysosomale et approche de la fonction.

The protein « p76 » (« hypothetical protein LOC196463 ») was identified some years ago in our laboratory during the course of a proteomic analysis of mannose-6-phosphate proteins purified from human cell lines. The present thesis describes the biochemical characterisation and the intracellular localisation of p76, as well as some functional tests carried out with recombinant p76. We demonstrated that human p76 sequence bears 6 N-glycosylations and that mannose-6-phosphate sugars were present. Proteolytic maturation of human and murine p76 precursors was observed; a few intermediate forms were partially characterised thanks to anti-p76 antibodies which were developed in the laboratory. Most importantly, we were able to demonstrate the lysosomal localisation of this protein by both immunofluorescence and sub-cellular fractionation of mouse liver homogenates. As p76 shows a significant sequence homology to a recently cloned phospholipase B from Dictyostelium discoideum, some functional tests were performed, but no phospholipase activity could be detected with recombinant hp76-myc. However, a fat blot experiment showed that hp76-myc binds cardiolipin, a particular phospholipid enriched in mitochondrial and bacterial membranes.La protéine p76 (« hypothetical protein LOC196463 ») a été identifiée au laboratoire lors d'une analyse protéomique ciblant les protéines mannose-6-phosphate de lignées cellulaires humaines U937 et MCF7. Ce rapport de thèse présente l'étude de cette protéine concernant certaines de ses caractéristiques biochimiques, sa localisation intracellulaire et l'approche de sa fonction. Ainsi, nous avons mis en évidence la présence de 6 N-glycosylations, ainsi que la présence effective de sucres mannose-6-phosphate. Une maturation protéolytique des précurseurs de la forme humaine et murine de p76 a été observée ; les chaînes issues de ces clivages ont été en partie caractérisées à l'aide des anticorps développés au laboratoire. L'étude de sa localisation intracellulaire par immunofluorescence et par fractionnements subcellulaires réalisés sur du foie de souris indique clairement que p76 est localisée dans les lysosomes. Enfin, p76 ayant une homologie de séquence avec une phospholipase B nouvellement caractérisée de Dictyostelium discoideum, des tests fonctionnels ont été mis en œuvre pour détecter une telle activité pour la protéine recombinante hp76-myc, mais sans succès. En revanche, une expérience de fat blot a montré que hp76-myc se lie à la cardiolipine, un phospholipide particulier des membranes mitochondriales et bactériennes