Microscopie non linéaire : chiralité et génération de second harmonique

Nonlinear microscopy : chirality and second harmonic generation Nonlinear microscopy enables functional 3D imaging of living thick tissues or cells. The contrast in imaging may come from synthetic dyes (exogenous contrast) or from proteins in tissues (endogenous contrast). We perform nonlinear microscopy with both of these approaches. In particularly, we use SHG (Second Harmonic Generation) and TPEF (Two Photon Excited Fluorescence). Our work on dyes for SHG microscopy rests on nonlinear optical study of the mechanims of optical activity in chiral molecules. The chirality of dyes should enhance SHG membrane’s imagery when molecules are in centrosymetric arrangement in membranes. We demonstratethat chirality of the dye must come from an excitonic coupling. We study such a colorant : the ASTB (Acridin Substituted Troger Base). We study and use two sources of endogenous contrast : collagen (SHG) and elastin (TPEF). After characterisation of their nonlinear optical properties, we demonstrate that the combination of TPEF and SHG in microscopy enables a morphological study of fresh living arterial tissue in Rats. We also show the dramatic effects of lindane (an insecticide) on the vascular system. We perform the first nanotoxinologic study in nonlinear microscopy based on SHG signal from myosin filaments. We measure a contracture of atrial frog cells with the introduction of a toxin (saxitoxin) with a resolution of 20 nm.Depuis 1990, la microscopie non linéaire de fluorescence excitée à deux photons (TPEF) ou de génération de second harmonique (SHG) a insufflé un nouvel élan à la microscopie optique. Il est possible de réaliser de l’imagerie fonctionnelle tridimensionnelle de tissus épais vivants ou de cellule. Le contraste provient soit de colorants optimisés pour l’imagerie nonlinéaire (contraste exogène), soit de protéines naturellement présentes dans les tissus comme l’élastine ou le collagène (contraste endogène). Nous abordons la microscopie non linéaire de ces deux points de vue, essentiellement en SHG mais aussi en TPEF. Notre travail sur les colorants pour la microscopie SHG s’appuie sur l’étude optique non linéaire des mécanismes intervenant dans l’activité optique des molécules chirales (la chiralité est la propriété d’un objet de ne pas être superposable à son image dans un miroir). La chiralité du colorant doit permettre d’améliorer l’imagerie membranaire de second harmonique quand les molécules se répartissent de part et d’autre de la membrane dans un arrangement centro-symétrique. Nous démontrons que le signal est conservé dans cette géométrie uniquement pour une chiralité par couplage excitonique. Dans ce but, nous avons travaillé sur un colorant synthétisé par le Laboratoire de Chimie de l’ENS de Lyon qui possède ce type de chiralité : l’ASTB (base de Troger substituée par deux acridines). Le travail sur ce colorant s’effectue alors dans deux directions, d’une part tester l'extension du modèle des oscillateurs couplés aux effets chiroptiques non-linéaires et d’autre part, montrer que ce colorant possède le type de chiralité optimal pour exalter le signal de second harmonique membranaire. La mesure résolue en polarisation du signal de second harmoniqueréfléchi par un film mince de ce colorant permet de valider notre modèle. Des vésicules artificielles mimant les membranes cellulaires permettent d’étudier son comportement comme colorant membranaire. Nous étudions et utilisons deux sources de contraste endogènes : le collagène (source de SHG) et l’élastine (source de TPEF). Après caractérisation des propriétés optiques non linéaires de ces deux protéines, nous montrons comment la microscopie non linéairecombinée de TPEF et de SHG peut remplacer avantageusement l’histologie classique. Nous démontrons la faisabilité d’une étude morphologique sur du tissu artériel épais vivant de Rat. Nous mettons alors en évidence les effets du lindane (un insecticide très répandu) sur le système cardio-circulatoire. L’étude montre de nombreuses altérations de l’élastine du tissucardiaque tant au niveau de l’aorte que de l’artère carotide. Ces altérations se retrouvent, en partie, dans les artères d’animaux non traités au lindane mais descendant de père traité avec une dose résiduelle de toxique. Ce travail montre l’existence d’effets de l’insecticide sur la descendance. Nous réalisons la première étude nanotoxinologique en microscopie non linéaire à partir du signal de second harmonique des filaments de myosine. Nous mesurons une contracture aurepos de cellules atriales de grenouille soumises à une toxine (la saxitoxine), avec une précision de 20 nm