Effet des agonistes des TRL sur la production des FRO par la NADPH oxydase des polynucléaires neutrophiles humains

Superoxide anion production by the neutrophil NADPH oxidase plays a key role in host defense; however, excessive superoxide production is believed to participate to inflammatory reactions. Neutrophils express several TLR that recognize a variety of microbial motifs or agonists. The interaction between TLR and their agonists is believed to help neutrophils to recognize and to eliminate the pathogen. However, the effects of some TLR agonists on the NADPH oxidase activation and the mechanisms controlling these effects have not been elucidated. In this study, we show that the TLR7/8 agonist CL097 by itself did not induce NADPH oxidase activation in human neutrophils, but induced a dramatic increase of fMLF-stimulated activation. Interestingly, CL097 induced cytochrome b558 translocation to the plasma membrane and the phosphorylation of the NADPH oxidase cytosolic component p47phox on Ser345, Ser328 and Ser315. Phosphorylations of Ser328 and Ser315 were significantly increased in CL097-primed and fMLF-stimulated neutrophils. Phosphorylation of Ser345, Ser328 and Ser315 was decreased by inhibitors of p38MAPK and the ERK1/2-pathway. Phosphorylation of Ser328 was decreased by a PKC inhibitor. Genistein, a braod range protein tyrosine kinase inhibitor, inhibited the phosphorylation of these serines. Our results also show that CL097 induced proline isomerase (Pin1) activation and that juglone, a Pin1 inhibitor, inhibited CL097-mediated priming of fMLF-induced p47phox phosphorylation and superoxide production. These results show that activation of TLR7/8 in human neutrophils induces hyper-activation of the NADPH oxidase by stimulating the phosphorylation of p47phox on selective sites, and suggest that p38MAPK, ERK1/2, PKC and Pin1 control this process.Zymosan a cell-wall preparation from saccharomyces cerevisiae is largely used to activate neutrophils in its opsonized form. In this study, we show that non-opsonized zymosan induced ROS production by human neutrophils. Interestingly, zymosan induced the phosphorylation of the NADPH oxidase cytosolic component p47phox on Ser345, Ser328 and Ser315; and activation of the GTPase Rac2. Phosphorylation of p47phox as well as Rac2 activation were inhibited by genistein a broad range protein tyrosine kinase inhibitor. Wortmannin a PI3Kinase inhibitor, inhibited phosphorylation of p47phox on Ser328 and Ser315 and Rac2 activation. SB203580 and UO126, inhibitors of p38MAPK and ERK1/2-pathway respectively, inhibited phosphorylation of p47phox on Ser345. GF109203X a PKC inhibitor inhibited phosphorylation on Ser328 and Ser315. Zymosan-induced ROS production was inhibited by genistein, wortmannin, SB203580, UO126 and GF109203X. These results show that zymosan induced ROS production by NADPH oxidase in human neutrophils via the phosphorylation of p47phox and Rac2 activation. Our results also suggest that a protein tyrosine kinase and PI3Kinase control p47phox phosphorylation and Rac2 activation while p38MAPK, ERK1/2 and PKC are involved in zymosan-induced p47phox phosphorylation.Le polynucléaire neutrophile (PN) humain est une cellule phagocytaire qui constitue une des premières barrières de défense de l’organisme contre les agents pathogènes. Sa stimulation par des facteurs chimioattractants, provoque sa migration de la circulation sanguine vers le foyer inflammatoire. Dans le site inflammatoire, les PN reconnaissent l’agent pathogène par l'intermédiaire d'opsonines, des fractions résultant de l'activation du complément et par l’intermédiaire de motifs de reconnaissance conservés au cours de l’évolution des agents pathogènes qui se lient à des récepteurs de la famille Toll (Toll-like receptors ; TLR). Le contact du pathogène avec le PN va provoquer sa phagocytose et sa destruction par la libération de molécules contenues dans les granules du PN et par la production de formes réactives de l’oxygène (FRO) par un complexe enzymatique la NADPH phagocytaire composée au repos de de protéines cytosoliques (p40phox, p47phox, p67phox et Rac 2) et membranaires (gp91phox et p22phox formant le cytochrome b558). Un des événements majeur de l’activation de la NADPH oxydase est la phosphorylation de certains composants cytosoliques comme la p47phox ou la p67phox ce qui conduit à la translocation de ces protéines vers le cytochrome b558 membranaire et permet d’activer l’enzyme pour la production de FRO. L’hyperactivation de cette enzyme ou son « priming » consiste en une pré-activation du PN par des agents dit « primants » tels que des cytokines (TNFα, GM-CSF, IL-1), des chimiokines comme l’IL-8, des molécules lipidiques (PAF et LTB4), ou encore des endotoxines bactériennes LPS, agoniste de TLR4. Les TLR sont des récepteurs exprimés à la surface de nombreuses cellules dont les cellules immunitaires ; ils détectent des motifs conservés au cours de l’évolution des agents pathogènes appelés PAMPs pour "pathogen-associated molecular patterns", des protéines modifiées reconnues comme étrangères, des lipides oxydés, des ligands endogènes. Quelques agonistes des TLR comme le LPS ont été décrits pour induire un priming de la production des FRO par les PN. D’autres ont été connus par leur pouvoir activateur de la NADPH oxydase des PN. Le CL097 (Imidazoquinoline : agoniste des TLR7/8) était l’agoniste des TLR induisant le plus fort effet de « priming » par les PN stimulés par le fMLP. Le CL097 induit la phosphorylation de la p47phox sur la sérine 345. Cette phosphorylation implique des MAPKinases ERK1/2 et de la p38MAPK. La phosphorylation de ce site induit le changement de conformation de la p47phox sous l’action d’une proline isomérase Pin1. Ce changement de conformation favorise la phosphorylation des autres sites (Ser-315, Ser-328) et par conséquent l’activation de la NADPH oxydase. La comparaison de l’effet du CL097 à deux agonistes reconnaissant l’un le TLR7, l’autre le TLR 8 a montré que l’action du CL097 dépendait du TLR8. Le zymosan non opsonisé (agoniste de TLR2) stimule l’activation de la NADPH oxydase des neutrophiles. IL induit la phosphorylation de la p47phox au niveau des Ser-345, -315 et -328. Ces phosphorylations font intervenir respectivement les MAPK ERK1/2 et p38, une protéine tyrosine kinase et les PKC. En plus cet agoniste active la petite protéine cytosolique Rac2, nécessaire à l’activation de la NADPH oxydase des PN. Ces données permettraient d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques de première importance afin de moduler les réponses inflammatoires pathologiques