Estudio de los perfiles metabolómicos en muestras de suero para el diagnóstico del cáncer de pulmón

El cáncer es una de las enfermedades de mayor relevancia en el mundo por su incidencia, prevalencia y mortalidad. De todos los tipos de tumores, el cáncer de pulmón (CP) representa el 15-20% de todas las neoplasias, por lo que se ha convertido en un problema sanitario de gran magnitud, siendo el tabaquismo el factor de riesgo que por sí solo provoca un mayor número de casos. Desafortunadamente, un 75% de los pacientes con este tipo de patología son diagnosticados en un estadio avanzado por la ausencia de síntomas en el inicio de la enfermedad, lo que ensombrece el pronóstico en gran medida. Por tanto, la prevención basada en el diagnóstico precoz y disminución de los factores de riesgo que predispongan al CP son a día de hoy la estrategia más útil para reducir la mortalidad por esta patología. En cuanto a los métodos de cribaje actuales, la publicación de la National Lung Screening Trial (NLST) en la que demuestra el descenso en la mortalidad en pacientes de alto riesgo para padecer cáncer de pulmón sometidos a cribado con Tomografía computarizada con dosis bajas de radiación (con una reducción del riesgo relativo del 20%), ha abierto una importante vía para el diagnóstico precoz de esta enfermedad. Una alternativa al uso de técnicas de imagen, es el estudio de los cambios metabólicos que se producen en el organismo con la aparición de procesos oncológicos, lo cual puede conducir a ia identificación de biomarcadores útiles para la detección precoz de determinados procesos. Aunque en general los resultados son muy alentadores no se puede afirmar la validez de ninguno de los biomarcadores encontrados hasta el momento para la detección precoz del CP. El objetivo principal de esta Tesis ha sido optimizar y aplicar un procedimiento metabolómico basado en infusión directa a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo tiempo de vuelo con fuente de electrospray (DI-ESI-QqQ-TOF-MS), para el análisis de muestras de suero sanguíneo de pacientes diagnosticados de cáncer de pulmón y sujetos sanos (CS), con el objeto de clasificar en base a sus patrones metabolómicos los dos grupos de estudio. En un segundo paso, se determinan los metabolitos causantes de esta discriminación, que pueden usarse como posibles biomarcadores en el CP. Para ello hemos realizado un estudio observacional prospectivo, con la inclusión de 60 muestras de suero (30 de pacientes con CP y 30 de sujetos sanos) basado en las técnicas metabolómicas descritas previamente, y posterior análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA), con el fin de clasificar los grupos a estudio y encontrar las variables (metabolitos) que determinen dicha clasificación. En los resultados obtenidos inicialmente se detectaron sesgos provocados por el alto índice de hemolisis de algunas muestras, el cual actúa como un factor perturbador en los resultados, reduciéndose la capacidad de discriminación con el aumento de las concentraciones de hemoglobina. Por ello se ha realizado un nuevo análisis con muestras con índice hemolítico inferior a 20 g/dl, incluyendo en esta ocasión 15 muestras en el grupo de CP, 16 en CS, y 15 de pacientes con enfermedades respiratorias diferentes a cáncer. Los resultados obtenidos tras el análisis mostraron una clara diferenciación entre los tres grupos a estudio, consiguiendo también la identificación de los siguientes metabolitos: fosfolípidos, glutamina y treonina con niveles sobreexpresados en el grupo de CP; L-Ornitina, Urea, lisofosfolípidos, y triacilglicéridos con niveles disminuidos en CP con respecto al grupo de CS. Todos estos metabolitos han sido relacionados con vías metabólicas conocidas en la patología del cáncer. Por otro lado, se ha realizado un estudio para valorar la influencia de la carga tabáquica en los perfiles metabólicos de pacientes con cáncer de pulmón, en comparación con sujetos sanos. Se han detectado diferencias en metabolitos presentes en ambos grupos, y la mayoría de estas anormalidades metabólicas se acentuaron en pacientes con una carga tabáquica elevada, lo que sugiere la influencia de este parámetro en la aparición de los procesos metabólicos relacionados con el CP. Estos resultados confirman la validez de técnicas metabolómicas utilizadas en la detección de metabolitos relacionados con el cáncer de pulmón, los cuales pueden suponer potenciales biomarcadores para el diagnóstico precoz de esta enfermedad.Cancer is one of the most important diseases in the world due to its incidence, prevalence and mortality. Amoung all types of tumors, lung cancer (LC) accounts for 15-20% of all neoplasias, so it has become a health problem of great magnitude. The number of cases of lung cancer and related deaths have been increased proportionally, mainly due to increased smoking rates, since according to data provided by the World Health Organization (WHO), smoking is the risk factor which causes by itself. Unfortunately, 75% of patients with this pathology are diagnosed at an advanced stage due to the absence of symptoms at the beginning of the disease, which worsens prognosis greatly. Therefore, prevention based on early diagnosis and reduction of risk factors that predispose to lung cancer are the most useful strategy to reduce mortality related with this disease today. Low-dose computerized tomography (LDCT) has become one of the most used screening methods to prevent and reduce the risk associated to this disease to a 20 %, which has open an good alternative to early diagnosis of this disorder. An alternative to the use of imaging techniques is the study of metabolic changes occurring in the organism on the oncological processes onset. This allows the identification of biomarkers associated to the early detection of oncological processes; nevertheless the results obtained today are not conclusive. In the present study it has been optimized and applied a metabolomics approach based in direct infusion of blood serum extracts into a triple quadrupole time of fight mass spectrometer (DI-ESI-QqQ-TOF-MS) provided with a electrospray source, using samples from diagnosed lung cancer patients (LC) and health ones (HS) in order to get samples classification into two clusters on the basis of their metabolomics profiles. In a second step, metabolites causing this discrimination were identified, which can be used as potential biomarkers of lung cancer. For this purpose, a prospective observational study, with the inclusion of 60 serum samples (30 patients with lung cancer and 30 healthy subjects) was performed, using the metabolic high resolution mass spectrometry techniques previously described, and subsequent discriminant analysis partial least squares (PLS- DA), in order to classify the groups to study and find the variables (metabolites) that determine this classification. Initial study presented biased results caused by the high rate of hemolysis in a number of samples, which represents a disturbing factor in the metabolic interpretation, especially in the ability of discrimination between groups, which decreases with increasing hemoglobin concentrations. Therefore, new samples with haemolytic index lower than 20 g/dl were analyzed, including 15 CP samples, 16 CS and 15 samples of a third group of patients with respiratory diseases different to lung cancer. The results showed a clear differentiation between the three groups, also getting the identification of the following metabolites: phospholipids, glutamine and threonine, with overexpressed levels in the group of CP; and L- ornithine, urea, lysophospholipids, and triacylglycerols, inhibited with respect to the CS group levels. All these metabolites are related to well established metabolic pathways in cancer pathology. In addition, the influence of tobacco burden on metabolic profiles of lung cancer patients has been assessed in comparison with healthy subjects. Differences between certain metabolites were ascertained especially associated to patients with high smoking load, suggesting the influence of smoking habit on the occurrence of these metabolic processes in CP. Finally, validity of metabolomic high resolution techniques for detection of metabolites associated to certain lung cancer processes was confirmed, which may provide potential biomarkers for early diagnosis of this disease