Production, characterization and utilization of the biomass from various sources

Biomass management is one of the most important issues in modern natural science as it is the basic category which spans through various disciplines of biotechnology. Whether animal, plant or microbial by its origin, biomass presents a vast source of food components, fine chemicals and bioactive molecules, which extraction, characterization and formulation can result in interesting new products destined for human consumption or as new materials in biomedicine. In the scope of this work, two natural biomass types were investigated – chicken skin as a source of collagen type I, and green microalga Chlorella sorokiniana biomass enriched in selenomethionine (SeMet). Chicken skin is a good alternative to traditional sources of collagen such as pork, bovine and carp that have some limitations. In the first part of this thesis, collagen type I from chicken skin was isolated, identified and characterized and molecular properties were compared to collagen from other animal skins. New methods (viscosimetry and ultrasonic spectroscopy) for molecular characterization of collagen were used. By ultrasonic attenuation, it has been determined that disaggregation and liquefaction phase starts at 40 °C in bovine collagen, whereas in chicken collagen starts at 50 °C. Using viscosimetry technique, denaturation temperature was found to be 50 °C, which is 10 °C higher than that obtained with bovine tendon collagen, confirming higher thermal stability of chicken skin collagen, probably because lysine levels in chicken collagen are two times higher than in bovine. Based on obtained results it could be concluded that due to its higher thermal stability and amino acid composition, chicken skin could be used as an excellent alternative source of collagen. The second phase of the thesis focused on the enrichment of green microalga C. sorokiniana biomass in SeMet by exposing cultures to selenate Se (+VI) during batch and continuous cultivation, and it was performed at the laboratory of Biotechnology of Algae from the Faculty of Experimental Sciences at the University of Huelva in Spain. Effect of selenate on viability, cell morphology and SeMet accumulation of the microalga C. sorokiniana grown in batch conditions was studied. Growth rate of cultures exposed to a sub-lethal 40 mg·L−1 (212 μM) of Se decreased about 25 % compared to control. EC50 of 45 mg·L−1 (238.2 μM) was determined for selenate. Ultrastructural studies with electronic microscope revealed cellular alterations. Electrophoresis of Se-exposed cell proteins suggests that selenate affects expression of the Rubisco gene. Microalga was able to accumulate up to 140 mg·kg-1 of SeMet in 120 h of cultivation. The second type of microalgae experiments focused on the enrichment of C. sorokiniana in SeMet, grown in continuous conditions in a 2.2 L photobioreactor, in a medium supplemented with selenate concentrations ranging from 5 to 50 mg·L-1. Continuous cultivation at several dilution rates was performed at 40 mg·L-1 selenate obtaining a maximum of 246 μg·L-1·day-1 of SeMet. Results suggest that an efficient batch and continuous cultivation of C. sorokiniana for the production of biomass enriched in the high value amino acid SeMet, at laboratory scale is feasible by carefully selecting sub-lethal selenate concentrations in culture medium as well as the culture dilution rates.La utilización de la biomasa es uno de los principales temas de interés en Biotecnologia. Ya sea de origen animal, vegetal o microbiano, la biomasa es una fuente de sustancias bioactivas cuya extracción puede resultar de interés en la obtención de nuevos productos destinados al consumo humano y/o animal. En esta tesis, se han utilizado dos tipos de biomasa de origen natural: piel de pollo como fuente de colágeno tipo I y biomasa enriquecida en selenometionina de Chlorella sorokiniana. En la primera parte de esta tesis, la piel de pollo se presenta como una alternativa frente al empleo de otras fuentes de colágeno tales como el cerdo, el ganado vacuno o las carpas. El colágeno tipo I procedente de pollo ha sido aislado y sus propiedades moleculares comparadas con las del colágeno procedente de otros animales. Con técnicas como la espectroscopía ultrasónica, se ha determinado que la fase de licuefacción en el colágeno de origen bovino empezaba a 40 ºC, mientras que para el colágeno de pollo era 50 ºC. Usando la técnica de viscosimetría, se confirmó 50 ºC como Tª de desnaturalización para el colágeno de pollo lo que representa 10 ºC más que la obtenida con el colágeno de tendón bovino, confirmando así su alta estabilidad térmica debido posiblemente a su alto contenido en lisina. Basándonos en los resultados obtenidos, el colágeno de la piel de pollo podría ser usado como una excelente fuente alternativa de colágeno tipo I. En la segunda parte de esta tesis, se realizaron experimentos enfocados al enriquecimiento de la biomasa de la microalga Chlorella sorokiniana en selenometionina añadiendo selenato Se (+VI) al medio de cultivo en condiciones de crecimiento tanto en discontinuo (baño) como en modo continuo. Esta parte se realizó en el laboratorio de Biotecnología de Algas de la Facultad de Experimentales de la Universidad de Huelva en España y fue parcialmente financiada con una ayuda eidA3-ceiA3 para la realización de tesis doctorales en cotutela por doctorandos extranjeros del Campus de Excelencia Internacional en Agroalimentación (ceiA3). Los resultados muestran que la tasa de crecimiento en cultivos sometidos a concentraciones subletales de selenio de 40 mg·L−1 (212 μM), disminuyó un 25 % respecto a la del cultivo control. También se determinó el valor de EC50 siendo éste de 45 mg·L−1 (238.2 μM). Estudios con microscopía electrónica revelaron daños en la estructura celular, mientras que los resultados de las electroforesis sugieren que se afecta al gen de la enzima Rubisco. Las células acumularon hasta 140 mg·kg-1 of SeMet tras 120 horas de cultivo. Se obtuvo biomasa de forma continua y con concentraciones crecientes de Se de 5 a 50 mg·L-1 usando un fotobioreactor y consiguiendo un máximo en la acumulación de SeMet de 246 μg·L-1·dia-1 con 40 mg·L-1 de selenato. Los resultados apuntan a que es posible obtener biomasa enriquecida en SeMet en modo continuo y a lo largo del tiempo y con una máxima productividad de SeMet, escogiendo bien la concentración subletal de selenio y las tasas de dilución.Úprava biomasy je jedním z nejdůležitějších problémů v moderních přírodních vědách, protože je základní kategorií týkající se zemědělství, potravinářství, ekologie, zpracování odpadu a biotechnologie. Ať už živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu, biomasa představuje obrovský zdroj surovin jako potravin, čistých chemikálií, bioaktivních molekul atd., jejichž izolace, charakterizace a formulace může vést k zajímavým novým produktům určeným pro lidskou spotřebu, nebo jako nový materiál v biomedicíně. Předložená studie byla zaměřena na výzkum dvou druhů biomasy - kuřecí kůže jako zdroje kolagenu t a biomasy mikrořasy Chlorella sorokiniana obohacené selenomethioninem (SeMet). V první části práce byl z kuřecí kůže izolován, identifikován a charakterizován kolagen typu I. Molekulární vlastnosti kuřecího kolagenu byly analyzovány a srovnány s jinými kolageny z živočišných kůží. Pro molekulární charakterizaci kolagenu byla použita viskosimetrie a ultrazvuková spektroskopie. Ultrazvukovou spektroskopií bylo zjištěno, že disagregace a zkapalňování hovězího kolagenu začíná při teplotě 40 °C, zatímco u kuřecího kolagenu začíná až při 50 °C. Viskosimetrie dále potvrdila vyšší tepelnou stabilitu kolagenu z kuřecí kůže, jeho denaturační teplota byla 50 °C, což je rovněž o deset stupňů více než u hovězího kolagenu. Kuřecí kolagen obsahuje dvakrát vyšší množství lysinu, což poskytuje tepelnou stabilitu kolagenu. Na základě získaných výsledků lze říci, že vzhledem ke své vysoké tepelné stabilitě a vhodnému aminokyselinovému složení, kuřecí kůže může být použita jako alternativní zdroj kolagenu typu I s aplikacemi v potravinářském průmyslu a biomedicíně. Druhá část práce byla zaměřena na obohacení biomasy zelené mikrořasy C. sorokiniana selenomethioninem. Experimentální část byla provedena v Laboratoři biotechnologie řas na Univerzitě Huelva ve Španělsku. Cílem první části experimentů bylo studovat vliv selenu na životaschopnost řas, morfologii buněk a akumulaci SeMet v biomase mikrořasy kultivované v dávkových kulturách. Subletální koncentrace Se v živném médiu, 40 mg∙L-1 (212 μM), snížila rychlost růstu o 25 % ve srovnání s kontrolní kulturou. Hodnota EC50 45 mg∙L-1 (238,2 μM) byla stanovena pro selenan. Ultrastrukturální studie ukazovaly na strukturální změny chloroplastu (granulární stroma, redukce thylakoid). Elektroforéza proteinů z biomasy mikrořasy ukazuje, že Se ovlivňuje expresi genu enzymu Rubisco. C. sorokiniana byla schopna akumulovat až 140 mg∙kg-1 SeMet během 120 h kultivace. Další část experimentální práce byla zaměřena na obohacování biomasy mikrořasy C. sorokiniana selenomethioninem během kontinuální kultivace s použitím 2,2 L bioreaktoru v kultivačním médiu s přídavkem koncentrace selenu v rozmezí od 5 do 50 mg∙L-1. C. sorokiniana rostla stejně ve všech testovaných koncentracích selenu kromě koncentrace 50 mg∙L-1, která byla již po krátké době kultivace letální. Během kontinuální kultivace se 40 mg∙L-1 selenu, bylo získáno maximálně 246 μg∙L-1 selenomethioninu denně. Výsledky ukazují, že kultivace v dávkových kulturách a dlouhodobá kontinuální kultivace mikrořasy C. sorokiniana pro získaní biomasy obohacené SeMet je možná pečlivým výběrem podmínek kultivace a subletálních koncentrací selenu v živném médiu