MicroRNAs diferencialmente expresados en cáncer de tiroides: funciones de miR-146b y miR-30a en la diferenciación y progresión tumoral tiroidea

Tesis doctoral inédita, leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 01 de abril de 2016Para caracterizar integralmente el transcriptoma y específicamente el miRNoma en el carcinoma tiroideo, realizamos un análisisis de expresión génica, por secuenciación masiva, de 8 carcinomas papilares tiroideos (CPT) y de su tejido tiroideo adyacente sano. Basándonos en predicciones bioinformáticas de potenciales dianas, hemos descrito una red de regulación que relaciona los genes más infraexpresados con los miRNAs más sobreexpresados en CPT. También hemos identificado un conjunto de miRNAs sobreexpresados que tienen elementos de reconocimiento en los 3'UTR de genes esenciales para la diferenciación tiroidea como NIS, TPO, TSHR, PAX8 and NKX2-1. Entre estos miRNAs observamos que el miR- 146b-3p -un miR cuyas dos hebras estaban entre las más sobreexpresadas en CPT- tenía como potenciales dianas a varios de estos genes. Mediante ensayos funcionales demostramos que el miR-146b-3p reduce los niveles proteicos NIS, PAX8 y FOXE1. Además, demostramos que tanto la inhibición sobre NIS, como PAX8, es ejercida a través de la unión a su 3‘UTR. Estos datos indican que la sobreexpresión tumoral de miR-146b-3p contribuye a la desdiferenciación tiroidea y en especial a la pérdida de la función de NIS mediante al menos 2 mecanismos complementarios: i) una regulación postranscripcional directa y ii) mediante el silenciamiento de PAX8 y FOXE1. El resultado global, fue una reducción significativa en la captación de yodo. Por otra parte, hemos identificado al supresor tumoral PTEN como una nueva diana de miR- 146b-5 en el carcinoma tiroideo. La sobreexpresión del miR-146b redujo los niveles proteicos de PTEN mediante la unión a su 3'UTR promoviendo la hiperactivación oncogénica de la vía PI3K. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión del miR-146b redujo los niveles nucleares de FOXO1 y p27 e incrementó los niveles de BCL-2. Inversamente, nuestros resultados mostraron que, tanto el oncogén RAS como el efector de la PI3K IGF-1, incrementaron la expresión del miR-146b. Así, en este trabajo proveemos de un nuevo mecanismo explicativo para: i) la actividad prooncogénica del miR-146b y ii) la reducción de PTEN observada en los tumores tiroideos. Por último, en este trabajo hemos descrito un eje regulatorio entre el miR-30a, uno de los más infraexpresados en CPT y la proteína oncofetal de unión a RNA, LIN28B. Nuestro resultados indican que ambos miembros se reprimen mutuamente y que comparten dianas comunes a las que regulan inversamente. También, confirmamos que la inhibición ejercida por el miR-30a sobre LIN28B está mediada por su 3'UTR. Por otra parte, determinamos los niveles de proteína de LIN28B en un panel de líneas celulares de carcinomas tiroideos y observamos que su expresión estaba relacionada con la existencia de mutaciones activadoras de la vía PI3K en líneas derivadas de carcinoma anaplásico. Además, validamos como dianas del eje a los inductores de la transición epitelio mesénquima HMGA2, SIX1 y EYA1, y a los efectores de la vía PI3K RAS, PI3Kß, BCL-2, CDK6 y p27(Kip). El efecto a nivel celular de la expresión del miR-30a fue una reducción de la invasión y la proliferación en las líneas celulares tiroideas. Inversamente, la sobreexpresión de LIN28B. Nuestros resultados indican la existencia de un eje LIN28B/miR-30a, de retroalimentación negativa doble, cuya desregulación oncogénica conlleva al silenciamiento del miR-30a y a la expresión aberrante de LIN28B contribuyendo a la progresión tumoral tiroidea.To comprehensively characterize microRNA (miR) and mRNA expression in thyroid cancer, we performed next-generation sequencing expression analysis of 8 papillary thyroid carcinomas (PTC) with paired samples of normal thyroid tissue. In this work, we identified, based on computational predictions of potential targets, a network relating the most abundant overexpressed miRs with the most downregulated targets in PTC. Also, we identified a set of upregulated microRNAs that target genes essential for thyroid differentiation (or thyroid iodide-metabolizing genes), such as NIS, TPO, TSHR, PAX8 and NKX2-1. Among these microRNAs, we found miR-146b-3p -a miR whose both strands were among the most highly overexpressed miRs in thyroid tumors - to putatively inhibit several of them. Performing functional studies we demonstrated that miR-146b-3p reduces NIS, PAX8, and FOXE1 protein expressión. Furthermore, we unveiled that both NIS and PAX8 inhibitions are specifically exerted through a direct binding to their 3‘UTRs. These data suggest that tumor overexpression of miR-146b-3p widely contributes to thyroid dedifferentiation and specially to NIS loss of function through at least two complementary mechanisms: (i) direct postranscriptional level, and (ii) through PAX8 and FOXE1 silencing. The general outcome was a significant decrease in iodide uptake in miR-146b-3p overexpressing cells. Furthermore, we identified the tumor suppressor PTEN as a novel target of miR-146b-5 in thyroid cancer. MiR-146b decreased PTEN mRNA and protein levels by direct binding to its 3‘UTR promoting tumoral hyperactivation of PI3K/AKT pathway. Additionally, mir-146b overexpressing cells showed decreased FOXO1 and p27 nuclear levels, and an increase of total BCL-2, mediating higher proliferation and survival rates. Conversely, our results showed that both constitutive overexpression of RAS and treatment with PI3K pathway effector IGF-1 resulted in increased expression of mir-146b in thyroid follicular cells. Thus, we provide a new mechanism to explain how miR-146b leads to a more aggressive tumoral behavior and an explanation on why PTEN levels are reduced in thyroid carcinomas. Next, we described a novel regulatory axis composed by PTC downregulated miR-30a and the oncofetal miRNA-binding protein LIN28B. Thus, we demonstrated that both members repress each other's expression and have a common pool of targets, which are inversely regulated by each of the axis members. Mir-30a-mediated LIN28B repression was found to be exerted by direct binding to its 3'UTR. We determined the expression levels of LIN28B in a panel of thyroid carcinoma cell lines and we showed it was linked to PI3K hyperactivating mutations in ATC derived cells. Moreover, we validated EMT inducers HMGA2, SIX1 and EYA1 and PI3K effectors RAS, PI3Kß, BCL-2, CDK6 and p27(Kip) as targets regulated by the axis. The general outcome was a significant decrease in invasion and proliferation in mir-30a overexpressing cells and, conversely, an increase in these parameters in LIN28B overexpressing cells. These data suggest the existence of a LIN28B/30a axis, with a double negative feedback regulation, whose tumoral shift, leading to overexpression of LIN28B and silencing of mir-30a, widely contributes to thyroid cancer progression