Identificación de péptidos y fármacos inhibidores basados en un nuevo mecanismo de inactivación para p38 MAPK

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 20-01-2016La vía de señalización de p38 MAPK puede ser activada por diferentes estímulos como inflamación o estrés oxidativo, y está implicada en multitud de procesos celulares como proliferación, diferenciación, apoptosis y supervivencia mediante la regulación de la expresión de diversos genes, incluyendo citoquinas proinflamatorias. El desarrollo de un inhibidor potente, selectivo y seguro para p38 ha sido un objetivo perseguido por la ciencia básica y la industria farmacéutica durante los últimos años que no se ha conseguido principalmente por falta de selectividad y efectos secundarios. El descubrimiento en nuestro laboratorio de un nuevo mecanismo de inhibición de p38α mediante la fosforilación por GRK2 (quinasa de receptores acoplados a proteínas G) en el residuo treonina 123, situado a la entrada del surco de anclaje de p38, nos ha permitido desarrollar una estrategia alternativa de inhibición dirigida a este dominio. El surco de anclaje es un dominio exclusivo de las MAPK que aporta afinidad y especificidad hacia sus sustratos y moduladores. En este trabajo hemos descubierto que la fosforilación de p38 por GRK2 puede bloquear la interacción de p38 con sustratos y activadores. Igualmente, hemos demostrado que GRK2 también puede fosforilar a la isoforma p38β2 en la serina 123. El mutante de p38β2 que imita la fosforilación por GRK2 fosforila con menos eficiencia aquellos sustratos que interaccionan con p38 a través del surco de anclaje. Además, este mutante muestra una capacidad catalítica alterada sobre sustratos independientes del surco de anclaje. Adicionalmente, hemos demostrado que GRK2 fosforila preferentemente a p38 en estado inactivo y que PP2A puede revertir in vitro esta fosforilación. Según estos resultados, hemos desarrollado una serie de péptidos diseñados a partir de los motivos-D de diversas proteínas que interaccionan con p38 incluyendo MKK6, MK2 y MEF2A para intentar inhibir la actividad y/o la activación de p38. Algunos de estos péptidos mostraron actividad inhibitoria sobre p38 in vitro y en células en el rango micromolar. El más eficaz fue el diseñado a partir de MEF2A fusionado con el péptido transportador de membrana TAT, y cuya secuencia fue modificada introduciendo una cisteína para intentar establecer un puente disulfuro con la cisteína 119 de p38. El péptido resultante, TAT-MEF2AxCys, mostró una potencia superior al péptido original de MEF2A, probablemente debido a la formación de este enlace, ya que el efecto inhibitorio es atenuado en presencia de un agente reductor. Este péptido inhibió la actividad de p38 in vitro con una IC50 de 3,7mM y bloqueó completamente la secreción de TNFa en la línea monocítica humana THP-1 a una concentración de 10mM y con una IC50 de 3mM. La sustitución de los aminoácidos L por sus enantiómeros D, siendo así resistentes a proteasas, mantuvo el efecto inhibitorio. Sin embargo, ambos péptidos redujeron la viabilidad de las células THP-1 a concentraciones no mucho mayores que las requeridas para la inhibición. Como aproximación alternativa, hemos identificado compuestos inhibidores de p38 seleccionados mediante cribado virtual dirigido al surco de anclaje de p38. Algunas familias de compuestos mostraron actividad inhibitoria de la ruta de p38 in vitro y en células. Entre ellas, la familia de benzo-oxadiazoles, en concreto el compuesto FGA-19, bloqueó completamente la actividad de p38 y la secreción de TNFα en células THP-1 a una concentración de 10mM, con una IC50 de 1,8mM y con una ventana de dos órdenes de magnitud entre las dosis inhibitorias y las dosis tóxicas medias. Es interesante resaltar que ambos, péptido TAT-MEF2AxCys y el compuesto FGA-19, pueden inhibir eficazmente p38 en un modelo murino de hiperalgesia inflamatoria, reduciendo la sensibilidad al dolor de los ratones, durante al menos 5 días, a niveles similares a los encontrados en los ratones control, con una concentración menor y un efecto más prolongado que el de inhibidores establecidos de p38 competitivos para el ATP.p38 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) signaling pathway is preferentially activated by different kinds of stress such as inflammation and oxidative stress and is implicated in diverse biological processes such as proliferation, differentiation, apoptosis and survival. p38 exerts its activity through the regulation of the expression of many genes including proinflammatory cytokines. The development of a strong, selective and safe inhibitor capable of regulating p38 activity has been pursued by academia and pharmaceutical industry during the last years without success, mainly because of the lack of selectivity and toxic secondary effects. The discovery in our lab of a new inhibitory phosphorylation of p38a by the multifunctional G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in threonine 123, a residue located at the entrance of the p38´s docking groove, has led us to the development of a new inhibitory strategy targeting this domain. The docking groove is a specific MAPK family cleft that confers affinity and specificity towards MAPK molecular partners. In this project we have characterized the effects of p38 phosphorylation by GRK2, and we have unveiled that it is able to block the interaction of p38 with both upstream activators and downstream substrates. We have also shown that GRK2 can phosphorylate the p38b2 isoform, in a serine at position 123. Moreover, a mutant of p38b2 that mimics GRK2 phosphorylation phosphorylates less efficiently those substrates that interact with p38 via the docking groove. Furthermore, this mutant shows an altered catalytic activity also towards docking-independent substrates. We have also characterized that GRK2 preferentially targets inactive p38, and that this phosphorylation can be reverted in vitro by PP2A phosphatase. Based on these results, we have developed a series of peptides designed from the D-motif of several molecular partners of p38 including MK2, MKK6 and MEF2A to try to inhibit p38 activity and/or activation. Several of these peptides showed an inhibitory activity towards p38 both in vitro and in cells in the micromolar range. The most effective one was based on MEF2A, linked to the cell-penetrating TAT peptide and whose sequence was modified introducing a cysteine to try to establish a disulfide bond with cysteine 119 in p38. The resulting peptide, TAT-MEF2AxCys, showed greater potency than the original MEF2A sequence, probably due to the formation of this disulfide bond since its inhibitory effect can be overcome by treatment with a reducing agent. This peptide inhibits p38 activity in vitro with and IC50 of 3.7mM and completely blocks TNFa secretion in human monocitic THP-1 cells at a 10mM concentration with an IC50 of 3mM. Replacement of L-aminoacids by D-enantiomers, thus creating protease-resistant peptides, maintains the inhibitory efficacy. However, both peptides decreased the viability of the THP-1 cells at concentrations not much higher than those required for the observed inhibitory effects. As an alternative approach, we have identified small molecule p38 inhibitors based on virtual screening on the p38 docking groove. Several families of compounds were found to have inhibitory activity in vitro and in cells towards the p38 route. Among them, the benzo-oxadiazol family, in particular the FGA-19 compound, completely abrogated p38 activity and TNFa secretion at concentrations of 10mM in THP-1 cells with an IC50 of 1.8mM and a reliable safety profile with two orders of magnitude between mean active and toxic doses. Interestingly, both the TAT-MEF2AxCys peptide and the small molecule FGA-19 can act as effective p38 inhibitors in a murine model of inflammatory hyperalgesia, reducing mice pain sensitivity for at least 5 days, to a level similar to that in control animals, at lower dose and lasting longer than established ATP-competitive p38 inhibitors