Caracterización de variantes genéticas en regiones reguladoras que afectan a la respuesta a hipoxia y su papel en enfermedades respiratorias obstructivas crónicas

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 16-12-2015Las variantes genéticas en regiones no codificantes del genoma pueden alterar la regulación de la expresión génica y, como consecuencia, tener múltiples efectos funcionales. De acuerdo con esta posibilidad, resultados previos del laboratorio demostraron que un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el sitio de unión del Factor Inducible por Hipoxia (HIF) puede alterar la inducción de genes específicos de hipoxia. Por otro lado, en enfermedades respiratorias, como la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) y el Síndrome de Apnea Obstructiva del Sueño (SAOS) la respuesta celular a hipoxia y por tanto la expresión génica regulada por HIF se encuentra activada en estos pacientes. Estas enfermedades tienen un origen multifactorial y presentan una evolución y pronóstico variable en función de la presencia de comorbilidades. Las causas de la evolución variable, incluida la aparición de comorbilidades, son desconocidas pero podría deberse a la diferente predisposición genética. En este trabajo estudiamos la variación genética en sitios de unión de HIF y su asociación con los diferentes fenotipos y comorbilidades en pacientes de EPOC y SAOS. Para ello, integramos datos experimentales de sitios de unión de HIF identificando 283 regiones del genoma que unen HIF. Posteriormente, estudiamos mediante secuenciación masiva de segunda generación (NGS) estas 283 regiones en muestras genómicas de 96 pacientes con EPOC y 144 pacientes con SAOS. Este análisis nos permitió identificar 72 variantes genéticas que alteran el núcleo central de unión de HIF, el motivo RCGTG. Para estudiar el efecto funcional de estas variantes, seleccionamos el SNP rs150921338 que se localiza en el promotor de PGK1 y el SNP rs6593210 en una región intrónica de EGFR y analizamos su efecto en la expresión de estos genes. Nuestros resultados, demuestran que estas variantes suprimen la inducción génica de estos genes por hipoxia. Además, mediante la edición del genoma con el sistema CRISPR/Cas9, pudimos confirmar que el SNP rs6593210 destruye un HRE funcional que controla la inducción de EGFR por hipoxia en la línea celular HEK293T. Por último, estudiamos la asociación entre las variantes genéticas identificadas y los diferentes fenotipos y comorbilidades de las enfermedades estudiadas. Nuestros resultados, pendientes de validación en una cohorte de pacientes independiente, sugieren que la variante genética rs118151281 se asocia con una mayor probabilidad de padecer hipertensión arterial y riesgo cardiovascular en pacientes de EPOC; y que el SNP rs1730190 y rs1657290 se asocia con una menor presencia de hipertensión arterial en pacientes de SAOS. En conjunto estos resultados sugieren que la variabilidad genética en motivos RCGTG en regiones no codificantes afecta la respuesta génica a la hipoxia y podría contribuir a la heterogeneidad observada en la evolución de enfermedades respiratorias crónicasGenetic variations in non-coding regions can modify gene expression and, as a consecuence, lead to multiple functional effects. Previous results of our laboratory showed that single nucleotide polymorphism (SNP) in hypoxia inducible factor (HIF) binding sites could disrupt transcriptional gene induction in hypoxia. On the other hand, it is known that in respiratory diseases, such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and Obstructive Sleep Apnea Syndrome (OSAS), hypoxic cellular response is activated and gene regulation mediated by HIF is triggered in these patients. These diseases have a multifaceted nature and show a variable prognosis and evolution according to the comorbidities. The causes of such heterogeneity, including the development of comorbidities, are unknown but could be due to different genetic background. In this study, we examined genetic variation in HIF binding sites and its association with phenotypes and comorbidities in COPD and OSAS patients. To do this, we integrated experimental data of HIF binding sites identifying 238 HIF binding regions in the genome. Subsequently, we studied by massive second-generation sequencing (NGS) these 238 regions in genomic samples of 96 COPD and 144 OSAS patients. This analysis allowed us to identify 72 genetic variants modifying the central core of HIF binding site, RCGTG motif. To study the functional effect of these variants, we selected SNP rs150921338 that localize in the promoter region of PGK1 and SNP rs6593210 in an intronic region of EGFR and we analyzed their effect the expression of these genes. Our results show that these genetic variants preclude gene induction in hypoxia. We confirmed through gene editing by CRISPR/Cas9 system, that SNP rs6593210 destroys the functional HRE that controls EGFR expression in hypoxia in HEK-239T cell line. On the other hand, we studied associations between identified genetic variants and phenotypes or comorbidities of the studied diseases. Our results, pending validation in a separate cohort of patients, suggest that the variant rs118151281 associates with a higher risk of arterial hypertension and cardiovascular risk in COPD patients, and SNP rs1730190 y rs1657290 associates with a lower risk of arterial hypertension in OSAS patients. Altogether, these results suggest that genetic variation in RCGTG motifs in non-coding regions could affect genetic response to hypoxia and could contribute to the observed heterogeneity in the evolution of chronic respiratory disease