Mecanismos intramoleculares de iniciación de la transmisión de señales por el TCR

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura 20-06-2005La activación del receptor para el antígeno de células T (TCR) puede producir diferentes respuestas dependiendo de la naturaleza del péptido antigénico enmarcado en el complejo principal de histocompatibilidad (MHCp). Este potencial implica la combinación de la especificidad de ligando por el TCR y de la activación de las distintas cascadas intracelulares de señalización. El mecanismo molecular que permite la discriminación se conoce parcialmente. El anticuerpo monoclonar APA1/1 reconoce un epítopo en el tallo citosólico de CD3ε que se expone cuando el TCR es activado completamente. La exposición del epítopo de APA1/1 se produce rápidamente e independientemente de la actividad tirosín-quinasa; de hecho, esta exposición se produce cuando las células son estimuladas a 0º C. Únicamente la estimulación del TCR con el ligando agonista fuerte induce la exposición del epítopo de APA1/1. En la mayoría de las células T en reposo en ganglios linfáticos, el epítopo de APA1/1 no está expuesto, pero tras la inyección del antígeno in vivo, el epítopo se expone en la mayoría de las células T específicas para el antígeno. Estos resultados demuestran que el TCR sufre un cambio conformación tras la unión del MHCp in vitro e in vivo, y se establece una correlación molecular con la activación productiva del TCR. Una característica única del TCR es su habilidad para explorar los ligandos de MHCp estructuralmente similares y transmitir diferencialmente las señales bioquímicas dependiendo de la fortaleza del reconocimiento del ligando. En el desarrollo de timocitos, los ligandos débiles inducen la selección positiva y los ligandos fuertes inducen la selección negativa. Una minoría de timocitos de ratones no transgénicos exponen el epítopo reconocido por APA1/1. Las células APA1/1 positivas son DP, están en la corteza y las uniones cortico-medulares y están en contacto con las células epiteliales y dendríticas. La población APA1/1 positiva aumenta en condiciones de selección negativa tanto en ratones transgénicos para el TCR restringido para MHC de clase I como de clase II. La mayoría de los timocitos APA1/1 positivos son TUNEL positivos, indicando que existe una correlación directa entre la exposición del epítopo de APA1/1 y la inducción de apoptosis mediada por ligandos de MHCp que inducen selección negativa. Aunque existen evidencias experimentales del cambio conformacional en CD3ε tras la estimulación del TCR, no se conoce la forma de transmisión del reconocimiento antigénico desde las subunidades reconocedoras del ligando TCRαβ a las subunidades señalizadoras del CD3. La estimulación del TCR induce una protección frente a la digestión con proteasas en los tallos de CD3ε y CD3ζ. Utilizando una aproximación termodinámica, se explican las propiedades de la conformación no activa y activa de los dímeros del CD3. Finalmente, se propone un modelo en el que la estimulación del TCR induce la rigidificación de la estructura y una compactación de los tallos del CD3.Triggering of the T-cell receptor (TCR) can produce very different responses, depending on the nature of the major histocompatibility complex/antigenic peptide (MHCp) ligand. This potential involves a combination of the precise ligand-binding specificities of the TCR and the activation of distinct intracellular signalling cascades. The molecular mechanisms that permit such fine discrimination are still only partially known. The monoclonal antibody APA 1/1 recognizes an epitope in the cytoplasmic tail of CD3ε which is only exposed when the TCR is fully activated. The exposure of the APA1/1 epitope is shown to be fast and independent of tyrosine kinase activity and takes place when T cells are stimulated at 0º C. Only the stimulation of the TCR with a full agonist ligand induces the exposure of the APA1/1 epitope. In most resting T cells in the lymph node the APA1/1 epitope is not exposed but, shortly after antigen injection in vivo, this epitope is exposed in most antigen-specific T cells. These results demonstrate that the TCR undergoes a conformational change upon MHCp binding in vitro and in vivo, and establish a molecular correlate for productive TCR engagement. A unique feature of the TCR is its ability to scan structurally similar MHCp ligands and transmit distinct biochemical signals depending on the strength of the ligand recognized. In developing thymocytes, weak TCR ligands induce positive selection and stronger ligands induce negative selection. A minority of thymocytes from non-transgenic mice display the epitope recognized by APA1/1. The APA1/1-positive cells are double positive thymocytes located in the cortex and in the CMJ, and are in close contact with epithelial and dendritic cells. The APA1/1-positive population increases under conditions that lead to negative selection in MHC class I and class II restricted TCR transgenic mice. The majority of the APA1/1-positive cells are also TUNEL-positive, indicating a direct correlation between the exposure of the APA1/1 epitope and the induction of apoptosis mediated by negatively selecting MHCp ligands. Although there is clear experimental evidence for the conformational change in CD3ε upon TCR stimulation, how the engagement of the ligand-recognition subunits TCRαβ is transmitted to the CD3 signalling subunits remains unclear. In this study, we show that stimulation of the TCR induces protection against protease digestion of CD3ε and CD3ζ tails. We also use thermodynamic arguments to explain the properties of the non-active and active conformations of the CD3 dimers. A model in which stimulation of the TCR induces a rigidification of the structure and a compacting of the CD3 tails is proposed