Methods to predict antibiotic resistance: From genes to metagenomes

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 21-10-2015As many antibiotics exist as many mechanisms of resistance will rise. Antibiotic resistance is a worldwide problem and deserves all sort of attention and dedication to identify the critical points which might promote or facilitate the emergence of novel resistance genes in one community, as well the propagation of the already known genes. The increasing of antimicrobial resistant organisms, mediated by the transference of genes vertically or horizontally and by spontaneous mutations represent a risk for human health. Frequently, bacteria suffer injuries from antibiotics, biocides and heavy‐metals, in clinical and environmental environments, which exert a selective pressure over these organisms interfering at the abundance and composition of environmental communities. This pressure of antimicrobials compounds leads to evolutionary and ecological consequences that are not fully understood and are highlighted in this work. For this purpose, we performed a comprehensive study of the effects leaded by antibiotics and biocides from the smallest genetic elements, as genes, passing through the organized arrangement of the genome and finishing in the complex group forming the metagenome. To this, wet‐lab techniques and bioinformatics approaches were applied to elucidate the main questions of this Thesis: (1) Does the presence of plasmids containing quinolone resistance genes affect the fitness of the cell? (2) Low‐level resistance qnr genes can evolve towards high‐level resistance?; (3) Infective and environmental strains of Stenotrophomonas maltophilia constitute two different phylogenetic branches?; (4) May the biocide triclosan exerts influence at the selection of antibiotic resistance genes and genetic mobile elements involved in the antimicrobial resistance in sludge from Waste Water Treatment (WWTP); (5) How does the presence of triclosan affects the taxonomic composition of an environmental microbiota? The answers for our questions were: (1) In the absence of quinolone selective pressure, the plasmids containing qnr resistance genes are expulsed from the cell to minimize the costs of maintaining useless elements inside; (2) Cells with the capability of generating their own mechanisms of resistance and adaptation to antibiotics do not make use of foreign helper genes and mutate their genomes; (3) Independently on the origin, clinical and environmental strains of S. maltophilia present similar genomic composition; there is not an "infective" S. maltophilia lineage; (4) Triclosan alters the number of antibiotic resistance genes present in a microbiota in a concentration‐dependent way; (5) Triclosan affects the composition of the microbiota collected from a WWTP. Altogether, these results serve to understand the multi‐level procedure that operates for selecting antibiotic resistance and propose different complimentary approaches to study this problemCuantos más antibióticos existan más mecanismos de resistencia surgirán. La resistencia antimicrobiana es un problema mundial que requiere el desarrollo de los esfuerzos necesarios identificar los puntos críticos que pueden promover o facilitar la emergencia de nuevos genes de resistencia en una comunidad, así como la propagación de genes ya conocidos. El aumento del número de organismos resistentes a los antimicrobianos causado tanto por la transferencia vertical y/o horizontal de genes como por mutaciones espontáneas representa un riesgo para la salud humana. Las bacterias sufren con frecuencia el daño producido por los antibióticos, biocidas y metales pesados, tanto en hábitats clínicos como ambientales, lo que produce una presión selectiva sobre los organismos, que a su vez puede alterar la abundancia y la composición de las comunidades ambientales. Esta presión selectiva causada por los compuestos antimicrobianos puede tener consecuencias evolutivas y ecológicas que no son completamente comprendidas y que son resaltadas en este trabajo. A tal fin, se realizó un estudio exhaustivo de los efectos causados por los antibióticos y biocidas desde los elementos genéticos más pequeños, como son los genes, pasando por la disposición y organización del genoma hasta elementos génicos más complejos como son los metagenomas. Para esto, utlozamos, tanto estudios experimentales, como aproximaciones en Bioinformática para analizar las principales preguntas de esta tesis: (1) ¿La presencia de plásmidos conteniendo los genes de resistencia a quinolonas afectan a la capacidad competitiva (fitness) de la célula? (2) ¿Los genes de resistencia a quinolonas de bajo nivel pueden evolucionar hacia la resistencia de alto nivel?; (3) ¿Las cepas de Stenotrophomonas maltophilia clínicas y ambientales constituyen dos ramas filogenéticas distintas?; (4) ¿El biocida triclosan ejerce influencia en la selección de genes de resistencia a antibióticos y elementos genéticos móviles que intervienen en la resistencia a los antimicrobianos en los lodos de las Estaciones de Tratamiento de Aguas Residuales?; (5) ¿Cómo la presencia de Triclosan afecta la composición taxonómica de la microbiota del medio ambiente? Las respuestas para nuestras preguntas fueron: (1) En ausencia de presión selectiva por quinolona los plásmidos que contienen genes de resistencia para este antibiótico son expulsados del interior de la célula minimizando los costes de mantenimiento de elementos poco útiles presentes en su interior; (2) Las células con la capacidad de generar sus propios mecanismos de resistencia y adaptación a los antibióticos no hacen uso de genes externos, sino que se seleccionan mutaciones en sus genomas; (3) Independientemente del origen, las cepas clínicas y ambientales de Stenotrophomonas maltophilia presentan una composición genómica semejantes no existiendo un linaje "infeccioso" de S. maltophilia; (4) El número de genes de resistencia a antibióticos en una microbiota es dependiente de la concentración de triclosan; (5) El biocida triclosan afecta a la composición de la microbiota de muestras colectadas de Estaciones de Tratamiento de Aguas Residuales. En conjunto, estos resultados sirven para entender los diferentes niveles de organización que actúan en la selección de resistencia a los antibióticos y proponer diferentes enfoques complementarios para estudiar este problem