Regulación de la expresión y actividad de IF1, el inhibidor fisiológico de la H+-ATP sintasa de la mitocondria

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 27-11-2015The mitochondrial H+-ATP synthase synthesizes most of cellular ATP requirements by oxidative phosphorylation (OXPHOS). The ATPase Inhibitory Factor 1 (IF1) is a nuclear-encoded mitochondrial protein known to inhibit the ATP hydrolytic activity of the H+-ATP synthase to preserve the proton electrochemical gradient in situations that compromise respiration. Recent findings in colon cancer cells indicate that inhibition of the H+-ATP synthase by IF1 also affects ATP synthetic activity thus promoting aerobic glycolysis and a reactive oxygen species (ROS)- mediated signal that enhances proliferation and cell survival. Herein we have studied the mechanisms that govern the regulation of the expression and activity of IF1 and show the tight regulation exerted by IF1 on the H+-ATP synthase. We illustrate that the overexpression of isoform 1 of IF1observed in human colon, lung, breast and ovarian carcinomas is exerted posttranscripcionally. We demonstrate that IF1 is a short-lived protein (t1/2 = 4 h) whose degradation depends on the activity of mitochondrial serine-proteases and on the inner mitochondrial membrane metalloprotease YME1L. In addition, we describe mechanisms that regulate translation of IF1 mRNA mediated by mitochondrial ROS and microRNA 24-3p. Moreover, this study also unveils a novel regulatory mechanism of IF1 activity: the phosphorylation of serine 39 of human IF1 by mitochondrial protein kinase A (PKA). Phosphorylation of IF1 abolishes its capacity to bind the H+- ATP synthase and hence to exert its biological activity on the enzyme. Only dephosphorylated IF1 binds and inhibits both the hydrolase and synthase activities of the enzyme. The phosphorylation status of IF1 regulates the flux of aerobic glycolysis and ATP production through OXPHOS in several cellular situations such as hypoxia or during cell cycle progression. Moreover, dephosphorylated IF1 is present in human carcinomas suggesting the importance of active IF1 for the tumorigenic phenotype. Remarkably, mouse heart contains a large fraction of dephosphorylated IF1 that becomes phosphorylated and inactivated upon in vivo β-adrenergic stimulation. Dephosphorylated IF1 is also less prone to its turnover than phosphorylated IF1. Overall, our results demonstrate the wide range of mechanisms that post-transcriptionally regulate IF1 expression and activity and stress the essential function of IF1 in regulating ATP output and energy metabolismLa H+-ATP sintasa es el complejo enzimático que se encarga de sintetizar la mayor parte de los requerimientos celulares de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS). El factor inhibidor de la ATPasa (IF1) es una proteína mitocondrial codificada en el núcleo cuya función descrita es la de inhibir la actividad ATP hidrolítica de la H+-ATP sintasa con el fin de preservar el ATP celular en situaciones que comprometen el funcionamiento de la cadena de transporte electrónico y la OXPHOS. Estudios recientes en diferentes tipos celulares implican que la inhibición de la H+-ATP sintasa por IF1 afecta además a la actividad ATP sintética produciendo un aumento de la glucolisis aeróbica y una señal mediada por especies reactivas de oxígeno (ROS) que aumenta la proliferación y supervivencia celular. En este trabajo estudiamos los mecanismos que controlan la expresión y actividad de IF1 demostrando la relevancia de la acción inhibidora mediada por IF1 sobre la H+-ATP sintasa. La sobreexpresión de la proteína observada en carcinomas humanos de colon, pulmón, mama y ovario se debe a cambios en la regulación post-transcripcional de la expresión de la isoforma 1 de IF1. Demostramos que IF1 es una proteína de vida media corta (t1/2 = 4 h) cuya degradación depende de serín-proteasas mitocondriales y de la metaloproteasa de membrana interna mitocondrial YME1L. También describimos mecanismos de regulación traduccional del mRNA de IF1 mediada por ROS mitocondriales y el microRNA 24-3p. En este trabajo se desvela un nuevo mecanismo regulador de la actividad de IF1: la fosforilación de la serina 39 del IF1 humano por una protein quinasa A (PKA) mitocondrial. La fosforilación de IF1 anula su capacidad para unirse a la H+-ATP sintasa. Solo el IF1 defosforilado se une e inhibe tanto la actividad hidrolasa como la sintasa del enzima. El estado de fosforilación de IF1 regula el flujo de la glucolisis aeróbica y la producción de ATP mediante OXPHOS en distintas situaciones celulares tales como la hipoxia o la progresión por el ciclo celular. Además, IF1 está en su estado defosforilado en carcinomas humanos sugiriendo la importancia del mismo para explicar el fenotipo tumoral. Es de destacar que el corazón de ratón contiene una fracción de IF1 defosforilado que se fosforila e inactiva ante una estimulación β-adrenérgica in vivo. IF1 defosforilado es también menos propenso a degradarse que el IF1 fosforilado. En conjunto los resultados de este estudio demuestran la amplitud de mecanismos que regulan de manera post-transcripcional la expresión de IF1 y su actividad, poniendo de manifiesto la función esencial de IF1 y de su forma defosforilada activa en la regulación de la producción de ATP y el metabolismo energéticoEl autor ha disfrutado de una Beca/contrato predoctoral del Programa Nacional de Formación de Personal Investigador (FPI-MICINN) asociada al proyecto BFU2010-1890