Identificación y caracterización de mutaciones en los genomas mitocondrial y nuclear en muestras de pacientes con miocardiopatías familiares

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 25-09-2015Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la concesión de un Proyecto de la SEC para Investigación Básica en Cardiología 2010 por parte de la Sociedad Española de Cardiología a los doctores Luis Alonso-Pulpón Rivera, Pablo García Pavía, Juan Arredondo Lamas, Belén Bornstein Sánchez y Margarita Cervera Jover; y gracias a la concesión de un Contrato de Formación de Personal Investigador 2011 por parte de la Fundación Para la Investigación Biomédica Hospital Universitario Puerta de Hierro Majadahonda a Pedro Félix Villar EspejoLas enfermedades mitocondriales comprenden un conjunto de patologías resultado de la disfunción del sistema de fosforilación oxidativa. Cada año, tanto en el genoma mitocondrial como en el nuclear, se describen nuevas mutaciones a la vez que se identifican nuevos genes implicados en el desarrollo de estas enfermedades. En pacientes con enfermedad mitocondrial, la predominancia de manifestaciones neuromusculares puede llegar a enmascarar la presencia de otros fenotipos clínicos como las miocardiopatías. Por tanto, la caracterización de las miocardiopatías con un origen mitocondrial es incompleta, siendo necesario comprender los mecanismos patogénicos implicados en su desarrollo. Por otro lado, se han descrito una gran cantidad de mutaciones en genes que codifican proteínas sarcoméricas implicados en el desarrollo de miocardiopatías. Es de interés general avanzar en la identificación y caracterización de nuevas mutaciones, tanto en genes mitocondriales como sarcoméricos, para comprender los distintos mecanismos patogénicos que subyacen a estas enfermedades. Previamente, nuestro grupo describió la mutación p.Gly128Cys en la proteína MYL3 en un paciente con miocardiopatía hipertrófica. Para determinar si esta mutación está implicada en el desarrollo de la enfermedad sería necesario realizar un estudio funcional. El coste de realizar un este tipo de análisis de nuevas mutaciones en modelos animales es muy elevado. Esto hace que sea necesario desarrollar un nuevo método de evaluación funcional. Aquí se plasma el resultado de un estudio retrospectivo, cuyo objetivo fue caracterizar clínica y molecularmente una cohorte de pacientes con miocardiopatía y enfermedad mitocondrial. Además, se propone la utilización de cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias de ratón, con el objetivo de evaluar la patogenicidad de nuevas mutaciones en genes sarcoméricos. Se revisaron historias clínicas de 2520 pacientes con sospecha de enfermedad mitocondrial. Únicamente, evidenciamos una disfunción cardíaca acompañante en 127 pacientes. El criterio clínico de inclusión en este estudio fue la presencia de una perturbación cardíaca acompañada por una disfunción mitocondrial. Sólo 71 pacientes cumplieron este criterio. De estos, sólo se pudo secuenciar el genoma mitocondrial (ADNmt) en 45 pacientes, entre los que se encontraron nueve variantes nucleotídicas distintas. Se analizó la patogenicidad de 3 de los cambios encontrados mediante el uso de cíbridos transmitocondriales. Además, se identificaron 3 cambios nucleotídicos en el ADNmt potencialmente relevantes en el desarrollo de la enfemedad y 3 cuya patogenicidad ya había sido confirmada. No se encontraron mutaciones en ninguno de los 13 genes nucleares analizados. En cuanto al ensayo funcional en cardiomiocitos derivados de células madre embrionarias, se analizaron mutaciones previamente descritas en la proteína sarcomérica MYL3 sin que se hayan obtenido resultados concluyentes. En conclusión, los ensayos funcionales siguen siendo necesarios para clasificar las distintas variantes en genes mitocondriales y sarcoméricos como patogénicas o polimórficas y poder explicar las características moleculares aún no caracterizadas de las miocardiopatías de origen familiar.Mitochondrial diseases are multisystemic disorders, which have arisen as result of oxidative phosphorylation system dysfunctions. New mutations in the mitochondrial and nuclear genomes are being described each year while new genes involved in the development of these diseases are identified. In patients with mitochondrial diseases, the predominance of neuromuscular manifestations could mask the presence of other clinical phenotypes such as cardiomyopathies. Hence, the characterization of cardiomyopathies with mitochondrial origin is incomplete. It is therefore necessary to understand the pathogenic mechanism involved in their development. On the other hand, a large number of mutations in genes that codify for sarcomeric proteins involved in the cardiomyopathy development have been reported. It is in public interest to make progress in the identification and characterization of new mutations in mitochondrial and sarcomeric genes to understand the different pathogenic mechanisms that cause these diseases. The p.Gly128Cys mutation in the MYL3 protein gene was identified by our group, in a patient with hypertrophic cardiomyopathy. It should be desirable to develop a functional assay to establish this mutation involvement in the disease. Given the very high cost of performing a functional assay in animal models, it should be developed a new functional evaluation method. We report a retrospective study which main objective was characterizing the clinical and molecular features of cardiomyopathy and mitochondrial disease in a cohort of patients. An additional aim is to develop a new method to evaluate the pathogenicity of mutations in sarcomeric genes. Clinical histories from 2,520 patients, which had been evaluated for presumed mitochondrial diseases were reviewed. Accompanying cardiac dysfunction was observed in only 127 patients. The clinical criterion for their inclusion in this study was the presence of a cardiac disturbance accompanied by mitochondrial dysfunction. 71 patients met this criterion. The mitochondrial genome (mtDNA) from 45 patients was sequenced. Nine different nucleotide variants were found. The pathogenicity of 3 of them was investigated using transmitochondrial cybrids. Besides, three other nucleotide changes in mtDNA may be relevant related to disease development and while the last 3 had a previously confirmed pathogenicity. No mutations were found in the 13 nuclear genes analyzed. The trial to set up an embryonic stem cellderived cardiomyocytes based functional assay did not show conclusive results for the mutations in the gene of MYL3 sarcomeric protein gene describe above. In conclusion, additional research should be made in order to classify mitochondrial variants as pathogenic or polymorphic and to identify nuclear genes that could explain molecular features of familiar cardiomyopathies uncharacterized to date