Caracterización del receptor de quimioquinas CCR8 y análisis de su función in vivo

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular, Fecha de lectura 16-07-2003El trabajo experimental que se presenta en esta memoria versa acerca del mundo de las quimioquinas y sus receptores, y sobre la importancia que éstos tienen en la actividad leucocitaria. Nace, concretamente, de la caracterización que Zaballos et al. hicieron del receptor de quimioquinas inicialmente denominado CKR-L1 y que posteriormente se ha dado en llamar hCCR8. En primer lugar, y habiendo establecido que la quimioquina hCCLl interacciona con este receptor de forma específica, se clonó su homólogo en ratón, mCCR8, señalando a mCCLl como su ligando, y situando la producción de su RNA mensajero en células de timo, nodulos linfáticos y bazo. Se obtuvo, asimismo, un anticuerpo monoclonal anti-mCCR8 con el que se advirtió, mediante citometría de flujo, la presencia del receptor en la superficie de timocitos CD4" CD8' (DN), así como en la de aquellos con fenotipo CD4+ (SP) que aún no han alcanzado su madurez. También pudo concluirse que las células CD4" CD8" (DN) CCR8+ de timo son may orí tari amenté TCRyS+ y en menor medida TCRyÓ'. Fue a través de experimentos de RT-PCR cuantitativa llevados a cabo sobre ratones Wild-Type y de diversos análisis de citometría efectuados con animales RAG2(K0) como se clarificó la expresión de CCR8 dentro de dicho compartimento CD4" CD8" (DN) TCRyó", localizándose ésta tanto en la subpoblación CD44+ CD25" (DN1) como en la CD44' CD25 (DN4). Por RT-PCR se percibió además la presencia de CCR8 en células Lin" Sca-1+ de médula ósea. Del mismo modo, se corroboró, en términos de proteína, el dato ya defendido previamente en la literatura que habla del incremento transitorio que, en linfocitos Th2, experimentan los niveles de mRNA de CCR8 en respuesta a activación, viéndose que se produce el mismo efecto en timocitos CD4" CD8" (DN) y CD4+ (SP) tras la estimulación del pre-TCR y el TCR respectivamente. Por otra parte, y con el ánimo de desentrañar la actividad biológica atribuible a este receptor de quimioquinas. se generaron ratones Knock-Out para CCR8. Estos animales, que en un análisis muy general no presentaron alteraciones significativas en timo, nodulos linfáticos, bazo y sangre periférica, mostraron, no obstante, una leve desorganización en la región subcapsular tímica, lo que parece poner de manifiesto la participación de CCR8 en el direccionamiento de los timocitos más inmaduros. Por último, queriendo caracterizar el posible papel que este receptor juega en linfocitos Th2, se estudió el comportamiento de ratones CCR8(KO) y CCR8(WT) ante diferentes modelos de una patología que cursa con la participación de este tipo de leucocitos como es el asma, llegando a concluirse que en ningún caso la falta de CCR8 afecta en modo alguno a su desarrollo. XIThe experimental work presented in this report is on the chemokines and chemokine receptors, and about how relevant they are for the leukocyte activity. It starts from the characterization that Zaballos et al. did of the human chemokine receptor initially known as CKR-L1 and now renamed CCR8. After stablishing that the chemokine hCCLl interacts specifically with hCCR8, the homologous murine CCR8 gene was cloned and its specific ligand mCCLl identifíed. Production of mCCR8 mRNA was observed in the thymus, spleen and lymph nodes by Northern blot analysis. Furthermore, a monoclonal antibody against mCCR8 was obtained. Using this mAb, we detected the presence of the CCR8 receptor on the surface of CD4" CD8" (DN) and immature CD4+ (SP) thymocytes by flow cytometry. Most of the CD4' CD8 (DN) CCR8+ cells in the thymus resulted TCRyó+ and only a few showed a TCRy6' phenotype. Quantitative real-time RT-PCR experiments with wild-type mice and flow cytometry analysis with RAG2(KO) animáis demonstrated that CCR8 expression in TCRy6" thymocytes is confined to CD44+ CD25- (DN1) and CD44" CD25" (DN4) subpopulations. Presence of CCR8 transcripts, moreover, was visualized in Lin" Sca-1+ bone marrow cells. Previous data reporting a transient increase of CCR8 mRNA levéis in activated Th2 lymphocytes were corroborated by protein analysis; and this transient CCR8 upregulation was also observed in CD4' CD8 (DN) andCD4+ (SP) thymocytes after pre-TCR andTCR stimulation, respectively. On the other hand, CCR8 knock-out mice were generated in order to study the in vivo role of this chemokine receptor. These animáis did not show major alterations in the thymus, spleen, lymph nodes or peripheral blood. However, a mild disorganization in the subcapsular región of their thymus was cleariy observed, suggesting a role of CCR8 in the positioning of immature thymocytes. Finally, we analyzed the behavior of CCR8(KO) and CCR8(WT) mice in several models of airways and peritoneal allergy, just to address the putative role of CCR8 in Th2 lymphocytes. Similar results were obtained with the two groups of animáis, leading to the conclusión that these allergic diseases course without critica! CCR8 participation. XI