Study of functions of shelterins and telomerase in aging and nuclear reprograming

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 21-11-2014Mammalian telomeres are nucleoprotein structures consisting of TTAGGG tandem repeats bound to a protein complex called shelterin, which protect chromosome ends from degradation, fusions and fragility. TRF1, one of the components of the shelterin that binds to dsDNA, has been shown to be essential for telomere protection and replication. Telomerase is an enzyme composed of a reverse transcriptase (TERT) and a RNA template (Terc) that has the ability to add telomere repeats de novo. Telomerase is expressed during embryonic development and in adult stem cell compartments of several tissues, but its activity is not sufficient to compensate for the accumulative telomere erosion associated aging. Telomeric repeats can also be found throughout the genome, as Internal or Interstitial Telomeric Sequences (ITSs). Furthermore, several shelterins have been described to bind to ITSs as well as to other extra-telomeric regions, some of them having key roles in transcriptional regulation. Here, we set to address whether TRF1 can be found at extra-telomeric sites in cells with both normal and critically short telomeres, contributing to the transcriptional alterations associated with aging. In particular, we performed a ChIP-sequencing technique to map TRF1 binding sites in wild-type and Terc-/- MEFs, concluding that TRF1 is exclusively located at telomeres in this type of cells. In 2006, Takahashi and Yamanaka achieved the nuclear reprogramming of somatic cells by the ectopic addition of the transcription factors Oct3/4, Sox2, Klf4 and cMYC, giving rise to the so-called induced pluripotent stem (iPS) cells. IPS cells closely resemble ES cells in their global gene expression and epigenetic patterns. Besides they overcome the ethical and immune-compatibility issues that limit the clinical use of ES cells. Telomerase activity, telomere length and TRF1 levels are increased in iPS cells and this increase correlates with higher pluripotency. In this way, knowledge of telomere remodeling during reprogramming is crucial for the possible applications of iPS cells in regenerative medicine. In this thesis, we demonstrated that the shelterin TRF1 is essential for the acquisition and maintenance of pluripotency, highlighting the importance of telomere protection and replication in stem cells biology.Los telómeros de mamíferos son estructuras nucleoproteicas que consisten en repeticiones TTAGGG unidas al complejo proteico shelterin y que protegen los extremos de los cromosomas de la degradación, fusiones y fragilidad. TRF1, uno de los componentes del shelterin de unión a DNA de doble hebra, es esencial para la protección y replicación telomérica. La telomerasa es una enzima compuesta por una transcriptasa reversa (TERT) y un RNA molde (Terc) que tiene la capacidad de añadir repeticiones teloméricas de novo a los extremos de los cromosomas. La telomerasa se expresa durante el desarrollo embrionario y en los compartimentos de células madre adultas en varios tejidos, pero su actividad no es suficiente para compensar la erosión telomérica asociada al envejecimiento. Las repeticiones teloméricas también se encontran a lo largo del genoma, como “sequencias teloméricas intersticiales” o ITSs. Además, se ha descrito que ciertas shelterinas se unen tanto ITSs como a otras regiones extra-teloméricas, teniendo papeles clave en la regulación transcripcional. En esta tesis, nos propusimos estudiar si TRF1 puede unirse a sitios extra-teloméricos en células con telómeros normales y críticamente cortos, contribuyendo así a las alteraciones transcripcionales asociadas con el envejecimiento. En concreto, realizamos un ChIP-sequencing con el fin de mapear los lugares de unión de TRF1 en MEFs wild-type y Terc-/-, concluyendo que TRF1 está exclusivamente localizada en telómeros en este tipo celular. En el 2006 Takahashi y Yamanaka lograron la reprogramación nuclear de células somáticas mediante la adición de los factores de transcripción Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc, dando lugar a las células madre pluripotentes inducidas (iPS). Las células iPS son similares a las células madre embrionarias (ES) en su expresión génica global y patrones epigenéticos. Adicionalmente, anularían los problemas éticos y de inmunocompatibilidad que limitan el uso clínico de las células ES. La actividad telomerasa, la longitud telomérica y los niveles de TRF1 aumentan en células iPS, estando este aumento correlacionado con la pluripotencia. De este modo, un conocimiento de la remodelación telomérica durante la reprogramación es crucial para las posibles aplicaciones de las células iPS en medicina regenerativa. En esta tesis, hemos demostrado que la proteína TRF1 es esencial para la adquisición y mantenimiento de la pluripotencia, enfatizando la importancia de la protección y replicación telomérica en la biología de las células madre