Interacciones de células del linaje osteoblástico con biomateriales: influencia en las comunicaciones celulares mediadas por factores solubles

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 20-02-2015La aleación Ti6Al4V se utiliza en la fabricación de implantes osteoarticulares debido a sus excelentes propiedades mecánicas, baja toxicidad y buena resistencia a la corrosión. La resistencia a la corrosión se debe a la formación espontánea de una capa de óxido en su superficie, cuya estabilidad se puede alterar en contacto con el medio fisiológico. Con el fin de mejorar la estabilidad de esta capa superficial, en este trabajo se ha sometido la aleación Ti6Al4V a tratamientos mediante percusión con láser (“Laser Peening”, LP) empleando dos densidades de pulsos de láser, 421 pulsos/cm2 o 2.524 pulsos/cm2. La capa superficial de las aleaciones tratadas mediante LP, con rugosidad en el rango submicrométrico, contiene TiO metaestable, además de Ti2O3 e hidróxido de aluminio en su zona más externa. En función de la densidad de pulsos empleada, el tratamiento genera rutilo en dicha capa superficial. Tanto las células madre mesenquimales como los osteoblastos humanos se adhieren a las aleaciones tratadas de forma similar que a la aleación sin tratar. Sin embargo, el proceso de adhesión no ocurre a través de la formación de adhesiones focales que contienen paxilina o FAK fosforilada en la tirosina 397. Ambos tipos celulares proliferan y forman matriz extracelular sobre las aleaciones tratadas de forma similar que sobre la aleación sin tratar. Las aleaciones tratadas favorecen tanto la maduración osteogénica de células madre mesenquimales como la formación de una matriz mineralizada por parte de osteoblastos. En este trabajo también se ha evaluado la influencia de biomateriales con diferentes características químicas y topográficas, tales como poliéster liso, poliestireno poroso, aleación de Ti6Al4V lisa o porosa e hidrogeles de fibrina, sobre el comportamiento de células madre mesenquimales humanas. Asimismo, hemos estudiado la influencia de estos biomateriales en la relación paracrina que establecen las células madre mesenquimales con células osteoblásticas, células madre mesenquimales o células endoteliales humanas. Se observó que las características de los materiales juegan un papel relevante en el control que las células madre mesenquimales ejercen sobre la viabilidad y actividad de los osteoblastos, condicionando tanto la producción de proteínas relacionadas con la organización de la matriz ósea por parte de éstos como la producción de factores implicados en el proceso de remodelado óseo. Además, también regulan el control que las células madre mesenquimales ejercen sobre la supervivencia, capacidad de migración y formación de estructuras tubulares de células endoteliales. Observamos asimismo que el sustrato sobre el que se cultivan las células madre modula las relaciones que establecen con poblaciones del mismo tipo celular con las que no establecen contacto directo, influyendo en su viabilidad. Finalmente, el estudio reveló que las características de los materiales en los que se siembran las células madre mesenquimales modula su respuesta a factores solubles secretados por osteoblastos, células madre mesenquimales y células endoteliales.Ti6Al4V alloy is the most widely used metallic biomaterial for the fabrication of orthopaedic implants due to its mechanical strength, good corrosion resistant and low toxicity. Its corrosion resistance is due to the oxide film, which forms spontaneously on exposure to air. The interaction with physiological fluids results in alteration of the stability of the passive layer, accounting for increased metal ion release. To improve the stability of the outer layer, Ti6Al4V alloy samples were subjected to Laser Peening (LP) treatment, using two different laser pulse densities, 421 pulses/cm2 or 2524 pulses/cm2. The superficial layer of treated samples, which exhibited roughness at the submicron-scale, contains metastable TiO, Ti2O3 and aluminum hydroxide. Depending on the laser pulse densities used, the surface of the treated Ti6Al4V alloy also contains rutile. Human mesenchymal stem cells and osteoblasts attach to same extent to treated and non-treated alloys. However, adhesion to LP-treated surfaces does not proceed through the formation of focal adhesions containing paxillin or FAK phosphorylated in tyrosine 397. Human mesenchymal stem cells and osteoblasts similarly proliferate and organize an extracellular matrix in treated and non-treated Ti6Al4V alloys. Compared to untreated alloy, osteogenic maturation of mesenchymal stem cells and osteoblasts matrix mineralization was enhanced in LP-treated alloys. We have also studied the influence of topographical and chemical characteristics of several biomaterials, namely smooth polyester, porous polystyrene, smooth and porous Ti6Al4V alloy and fibrin hydrogel, in human mesenchymal stem cells behavior. In addition, the influence of these biomaterials in the paracrine cross-talks that establish, in the absence of direct contact, human mesenchymal stem cells and human osteoblasts, mesenchymal stem cells or endothelial cells was evaluated. The topographical and chemical characteristics of the materials influence the control that human mesenchymal stem cells exert on osteoblast viability and activity, tuning the production of proteins associated with ECM organization and factors related with bone remodeling. Also, the remote control of mesenchymal stem cells on endothelial cell survival, migration and formation of tubule-like structures as well as on the viability of mesenchymal stem cells is influenced by biomaterials characteristics. Finally, the study revealed that the topographical and chemical characteristics of biomaterials where human mesenchymal stem cells are seeded modulate their response to paracrine factors secreted by human osteoblasts, other mesenchymal stem cells and endothelial cells