Functional characterization of AmpC β-lactamase and role of LMM-PBPs in peptidoglycan composition, β-lactam resistance and ampC regulation in Pseudomonas aeruginosa

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 21-11-2014Pseudomonas aeruginosa is one of the most problematic versatile Gram-negative bacteria in causing opportunistic human infections which are particularly difficult to treat because of its intrinsic resistance to antibiotics, as a consequence of many intervening resistance mechanisms involving the ability to overproduce the chromosomally encoded cephalosporinases, Pae-AmpC, which are periplasmic enzymes, belong to group I class C serine β-lactamases and are also responsible of bacterial resistance in many bacteria. In P. aeruginosa, ampC expression is regulated mainly by AmpG permeases, AmpD amidases, AmpR, NagZ, and two competing AmpR-binding muropeptides [UDP-MurNAc-pentapeptides (ampC suppressor) and 1,6-anhydromuropeptides (ampC inducer)]. Low molecular mass penicillin-binding proteins [LMM-PBP; e.g. PBP4 (DacB), PBP5 (DacC), PBP7 (PbpG)] are a group of periplasmic enzymes that have DD-carboxypeptidase and/or DD-endopeptidase activities which participate in cell separation, peptidoglycan (PG) maturation and recycling. Binding of β-lactams (e.g. penicillin) with LMM-PBPs causes an increase in anhydromuropeptides and periplasmic AmpC overproduction to hydrolyze that external unwelcome inducer. This study aims to highlight and to characterize the functions of Pae-AmpC and the role of LMM-PBPs PBP4, PBP5 and PBP7 in PG composition and bacterial resistance in P. aeruginosa; also, to study the role of these LMM-PBPs in Pae-ampC regulation and to see if they are needed for the recovery of rod shape of imipenem-induced round cells in P. aeruginosa. To fulfill this study we characterized several Pae-AmpC forms (wild type and mutants) in wild type and mutants of E. coli and in P. aeruginosa PAO1 strain which were tested for their PG composition by HPLC analysis and for bacterial resistance by disc diffusion method. Also, we constructed single and combined mutants of dacB, dacC, pbpG and ampC in PAO1 strain which were tested for their PG composition, ampC expression by RT-PCR, β-lactams susceptibility and their PBPs pattern by Bocillin-FL binding test. We analyzed PG composition and PBPs pattern in imipenem-induced round cells and their rod shape recovered cells in PAO1. We found that some Pae-AmpC mutants had a very low β-lactamase activity (AmpC-F4:C3 and AmpC-F4:C6); the mature form of Pae-AmpC had a high β-lactamase activity and a secondary DD-endopeptidase and DD-carboxypeptidase activities; only dacB single and combined mutations produced high ampC expression and β-lactam resistance; only dacC single and combined mutations produced maximum increase of PG pentapeptides. The triple mutant of dacB, dacC and pbpG displayed the largest increase in ampC expression and β-lactams resistance. Microscopic examination of all the constructed Pae mutants showed that they still retain their rod shape morphology similar to their parental PAO1 strain. Also, we found that activities of DacB, DacC and PbpG are not essential for recovery of rod shape in imipenem-induced spheres in P. aeruginosa.P. aeruginosa es una de las bacterias Gram-negativas versátiles y más problemáticas causantes de infecciones oportunistas en humanos y que son particularmente difíciles de curar debido a su resistencia intrínseca a los antibióticos, como consecuencia de los muchos mecanismos de resistencia intervinientes, y que implica la capacidad de sobreproducir las cefalosporinas codificados cromosómicamente, Pae-AmpC. En P. aeruginosa, la expresión de ampC se rige principalmente por la permeasa AmpG, la amidasa AmpD, AmpR, NagZ y dos muropéptidos competidores fijadores de AmpR [UDP-MurNAc-pentapéptido (supresor de ampC) y 1,6-anhidro-muropéptidos (inductor de ampC)]. Las proteínas (de baja masa molecular) fijadoras de penicilina [LMM-PBP; por ejemplo PBP4 (DacB), PBP5 (DacC), PBP7 (PbpG)] son un grupo de enzimas periplásmicas que tienen actividades DD-carboxipeptidasa/DD-endopeptidasa y que participan en la separación celular, y en la maduración y reciclaje del peptidoglicano (PG). La unión de un β-lactámicos (por ejemplo, penicilina) a las LMM-PBP provoca un aumento en anhidro-muropéptidos y sobreproducción de AmpC en periplasma para hidrolizar este inductor externo no deseado. Este estudio tiene como objetivo destacar y caracterizar las funciones de Pae-AmpC y la implicación de PBP4, PBP5 y PBP7 en la composición del PG y la resistencia bacteriana en P. aeruginosa y además, analizar el papel de estas LMM-PBPs en la regulación de Pae-ampC y determinar si son necesarias para la recuperación de la forma bacilar a partir de esferoplastos de P. aeruginosa inducidos por imipenem. Para realizar este estudio hemos caracterizado varias formas de Pae-AmpC en E. coli y P. aeruginosa PAO1 que se ensayaron mediante la determinación de su composición del PG por análisis de HPLC y su resistencia bacteriana por el método de difusión en disco en agar. Además, hemos construido mutantes individuales y combinados de dacB, dacC, pbpG y ampC en la cepa PAO1. Además, se analizó la composición del PG y los patrones de PBP en esferoplastos inducidos por imipenem y de sus formas bacilares recuperadas en PAO1. Hemos encontrado que algunos mutantes de Pae-AmpC tenían una actividad muy baja β-lactamasa (AmpC-F4: C3 y AmpC-F4: C6); que el tipo silvestre de Pae-AmpC (AmpC-F4) tenía una alta actividad β-lactamasa y unas actividades secundarias de DD-endopeptidasa y DD-carboxipeptidasa; que sólo mutaciones individuales en dacB y combinadas producen una alta expresión de ampC y resistencia a β-lactámicos; que sólo mutaciones individuales en dacC y combinadas producen un aumento máximo de pentapéptidos en el PG. El triple mutante de dacB, dacC y pbpG mostró el mayor aumento en la resistencia a β-lactámicos y en la expresión de ampC. El examen microscópico de todos los mutantes construidos en PAO1 mostró que todavía conservan sus formas morfologías bacilares similar a su cepa parental PAO1. Las actividades de DacB, DacC y PbpG no son esenciales para la recuperación de la forma bacilar en los esferoplastos de P. aeruginosa inducidos por imipene