Interacción de la metaloproteinasa de matriz 9 con células de leucemia linfocítica crónica: caracterización bioquímica funcional

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 18-06-2014Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the accumulation in the peripheral blood of CD5+ B lymphocytes and their progressive infiltration of the bone marrow and secondary lymphoid organs. These migration processes are mediated, among other molecules, by matrix metalloproteinases (MMPs). We and others have reported that proMMP (92 kDa) is the major MMP in CLL cells and plays an important role in CLL migration and invasion. Moreover, in contrast with normal B cells, proMMP‐9 is present at the CLL cell surface. Using immunoprecipitation, cell fractionation and confocal microscopy we have demonstrated that α4β1 integrin and 190 kDa CD44v constitute a docking complex for proMMP‐9 in CLL cells. Binding of proMMP‐9 to this complex inhibited cell migration and induced cell survival, thus contributing to CLL progression. Using proMMP‐9 recombinant proteins containing deletions of various domains, we show that the proMMP‐9 hemopexin domain (PEX9) is required for its interaction with CLL cells. Since this interaction may constitute a therapeutic target in CLL, and to help designing specific inhibitors, we have addressed its detailed study. CLL cells bound to the GST‐PEX9 fusion protein generated here, but not to GST, and this binding was primarily mediated by α4β1 integrin. Upon the preparation of truncated GSTPEX9 forms containing the structural blades D1D2 or D3D4, we have demonstrated that CLL cells also efficiently bound to the GST‐D1D2 and GST‐D3D4 proteins and this binding involved two different receptors: GST‐D3D4 primarily bound to α4β1 integrin, while GST‐D1D2 bound to CD44. Furthermore, both regions, D1D2 and D3D4 inhibited CLL cell migration. By preparing overlapping synthetic peptides spanning the entire PEX9 sequence, we identified two specific cell binding sites: The FPGVPLDHDVFQYREKAYFC sequence, located in D1 and contained in peptide P6 and the FDAIAEWIGNQLYFKDGKYW sequence, located in D4 and contained in peptide P3. Both peptides inhibited cell adhesion to proMMP‐9 and GST‐PEX9 as well as transendothelial migration. Moreover, combination of P3 and P6 synergistically increased the inhibitory effect of the individual peptides. Therefore, P3 and P6 could constitute excellent targets to prevent proMMP‐9 contribution to CLL pathogenesis. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is also involved in the extravasation and survival of CLL cells. VEGF is a proangiogenic factor also produced by CLL cells and whose elevated levels correlate with bad prognosis. Our results have demonstrated that addition of VEGF to CLL cells significantly reduced proMMP‐9 expression and in a dose‐dependent manner. Inhibition of VEGFR2 blocked this effect, indicating that VEGF signaled through this receptor. Reduction of proMMP‐9 resulted in inhibition of CLL migration through endothelium or Matrigel, confirming the important role of proMMP‐9 in these processes. RT‐PCR analyses indicated that VEGF regulation of proMMP‐9 was at the transcriptional level. Indeed, VEGFVEGFR2 interaction induced phosphorylation of the transcription factor STAT1 and STAT1 silencing restored proMMP‐9 production and CLL migration. As both, VEGF and proMMP‐9, are abundant components of the LLC microenvironment we have also studied the possible regulation of VEGF by proMMP‐9. CLL cell incubation with proMMP‐9 transcriptionally upregulated VEGF levels. In contrast, cell incubation with GST‐PEX9 reduced VEGF expression. These results were confirmed in vasculogénesis assays, where CLL cells preincubated with proMMP‐9 increased tube formation in co‐cultures with HUVEC cells, while preincubation with GST‐PEX9 inhibited vasculogénesis Additionally, immunoprecipitation analyses indicated a possible association between the receptors for proMMP‐9 (α4β1/CD44 ) and VEGF (VEGFR2), that could potentiate intracellular signaling and CLL cell expansion. Altogether, our results provide novel evidences for the pathogenic role of proMMP‐9 and VEGF in CLL and strongly suggest that both proteins could be good therapeutic targets in this malignancy.La leucemia linfocítica crónica B (LLC) se caracteriza por la acumulación en sangre periférica de linfocitos B CD5+ y su progresiva infiltración de médula ósea y órganos linfoides secundarios. En estos procesos de migración intervienen, entre otras moléculas, las metaloproteinasas de matriz (MMPs). Nuestro grupo, así como otros investigadores, ha demostrado que la proMMP‐9 (92 kDa) es la principal MMP producida por células LLC y juega un papel esencial en la migracion e invasion de células de LLC. Además, y a diferencia con linfocitos B normales, proMMP‐9 está presente en la membrana de células LLC. Por medio de inmunoprecipitaciones, fraccionamiento celulares y microscopía confocal hemos demostrado que la integrina α4β1 y 190 kDa CD44v constituyen un complejo receptor de proMMP‐9 en células LLC. La unión de proMMP‐9 a este complejo inhibía la migración de células LLC e inducía supervivencia celular, contribuyendo por tanto a la progresión de la LLC. Utilizando proMMP‐9 recombinantes con delecciones en varios dominios, hemos demostrado que el dominio hemopexina de proMMP‐9 (PEX9) es necesario para su interacción con células LLC. Dado que que esta interacción puede constituir una buena diana terapéutica en la LLC y con el fin de poder diseñar inhibidores específicos, hemos abordado su estudio en detalle. Las células LLC se unían a la proteína de fusión GST‐PEX9 generada en este estudio, pero no a GST, y esta unión era fundamentalmente mediada por la integrina α4β1. Mediante la preparación de formas truncadas de GST‐PEX9 que contenían los subdominios estructurales D1D2 o D3D4, hemos demostrado que las células LLC se unían también eficazmente a las proteínas GST‐D1D2 y GST‐D3D4 y que esta unión era a través de receptores celulares diferentes: GST‐D3D4 interaccionaba principalmente con la integrina α4β1 mientras que GSTD1D2 se unía a CD44. Además, ambas regiones, D1D2 y D3D4 inhibían la migración de células LLC. Por medio de la preparación de péptidos sintéticos solapantes que abarcaban toda la secuencia de PEX9, hemos identificado dos sitios específicos de unión a células: La secuencia FPGVPLDHDVFQYREKAYFC localizada en el subdominio D4 y contenida en el péptido P3, y la secuencia FDAIAEWIGNQLYFKDGKYW del subdominio D1, contenida en el péptido P6. Ambos péptidos inhibían la adhesión celular a GST‐PEX9 y proMMP‐9 y la migración transendotelial. Además, la combinación de P3 y P6 aumentaba sinergísticamente el efecto inhibidor de cualquiera de ellos. Los sitios P3 y P6 podrían constituir por tanto unas dianas excelentes para prevenir la contribución de proMMP‐9 a la patogénesis de la LLC. Otra molécula implicada en la extravasación y supervivencia de células LLC es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). VEGF es un factor proangiogénico que, al igual que proMMP‐9, es producido por células de LLC en niveles elevados, siendo un indicador de mal pronóstico. Nuestros resultados han demostrado que la adición de VEGF a células LLC reducía significativamente, y de manera dosis dependiente, la expresión de proMMP‐9. Este efecto se bloqueaba inhibiendo VEGFR2, indicando que este era el receptor implicado en la señalización por VEGF. La disminución de proMMP‐9 conllevaba una inhibición de la migración transendotelial o a través de Matrigel, confirmando el importante papel de proMMP‐9 en estos procesos. Análisis por RT‐PCR indicaron que la regulación de proMMP‐9 por VEGF era a nivel transcripcional. De hecho, la interacción VEGF‐VEGFR2 inducía la fosforilación del factor de transcripción STAT1 y el silenciamiento de STAT1 restauraba la producción de proMMP‐9 y la migración de células LLC. Dado que tanto VEGF como proMMP‐9 son componentes abundantes del microambiente de la LLC hemos estudiado también la posible regulación de VEGF por proMMP‐9. La incubación de células LLC con proMMP‐9 aumentaba los niveles de VEGF a nivel transcripcional. Por el contrario, la incubación con GST‐PEX9 disminuía la expresión de VEGF. Estos resultados fueron corroborados en ensayos de vasculogénesis, donde células LLC preincubadas con proMMP‐9 aumentaron la formación de tubos en cocultivos con células HUVEC, mientras que la preincubación celular con GST‐PEX9 inhibía la vasculogénesis. Adicionalmente, análisis por inmunoprecipitación indicaron una posible asociación entre los receptores de proMMP‐9 (α4β1/CD44) y VEGF (VEGFR2), que podría conllevar una potenciación de la señalización intracelular y la expansión de células LLC. En conjunto, nuestros resultados aportan nuevas evidencias del papel patogénico de proMMP‐9 y VEGF en la LLC y apoyan que ambas proteínas pueden ser buenas dianas terapéuticas en esta patologí