Búsqueda de perfiles moleculares diferenciales entre tolerancia y sensibilización en la respuesta alérgica

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-02-2014Objetivo: La sensibilización y la tolerancia (natural o inducida) frente a alérgenos puede deberse a múltiples y diferentes mecanismos. El objetivo principal de este estudio es encontrar diferencias moleculares que indiquen la aparición o no de la enfermedad, en la respuesta al polen de olivo, con el fin de definir biomarcadores y/o posibles dianas terapéuticas, que nos ayuden a mejorar el diagnóstico, pronóstico y/o el tratamiento. Materiales y Métodos: Se seleccionaron 84 sujetos, clasificados clínicamente en 5 grupos: Grupo 1 (no alérgicos), Grupo 2 (asintomáticos, con anticuerpos IgE frente al polen de olivo), Grupo 3 (alérgicos, pero no al polen de olivo), Grupo 4 (alérgicos al polen de olivo, sin tratamiento) y Grupo 5 (alérgicos al polen de olivo tratados con inmunoterapia específica), de los que se obtuvieron suero y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) durante y fuera del periodo de polinización. En el suero, se determinaron los niveles de IgE total y de los anticuerpos IgE, IgA e IgG4 específicos al polen de olivo, así como de un perfil de citocinas Th1, Th2, Treg y Th17. A partir de las PBMCs, se extrajo el RNA y se analizó la expresión del gen FOXP3 mediante qRT-PCR. La presencia de células reguladoras fue analizada mediante microscopía confocal en PBMCs en suspensión (sin fijación). Por otro lado, se realizó un análisis masivo de expresión génica mediante microarrays, a partir de RNA obtenido de las PBMCs (durante y fuera del periodo de polinización) de 6 sujetos de cada grupo. Tras hacer análisis de calidad de los datos con programas específicos y obtener la expresión diferencial según las condiciones experimentales, se llevaron a cabo análisis funcionales con KEGG para rutas y con Gene-Ontology para los procesos biológicos, seleccionándose finalmente, 93 genes representativos y diferenciales que fueron validados por qRT-PCR. Resultados: Los mayores niveles de anticuerpos IgE específicos se observaron en los sujetos alérgicos al polen de olivo (con o sin inmunoterapia), los sujetos tratados con inmunoterapia mostraron los niveles más altos de anticuerpos IgG4 específicos y los sujetos asintomáticos, los mayores niveles de IgE total. El resultado más relevante del análisis de citocinas fue el descenso de los niveles de TGF-β en los sujetos alérgicos al polen de olivo no tratados, durante la polinización. En este mismo grupo, se encontró un descenso en la expresión de FOXP3 y una menor cantidad de células reguladoras. Los resultados de expresión génica masiva mediante el Análisis de Componentes Principales (PCA), mostraron la buena clasificación clínica de los grupos, ya que, se obtuvieron 5 agrupamientos, que correlacionaban con los 5 grupos clínicos del estudio. Se encontraron genes y rutas diferenciales (relacionados o no con la respuesta inmuno-alérgica) entre los 5 grupos, siendo en general, mayores las diferencias entre los sujetos alérgicos y los controles (no alérgicos o asintomáticos). De los 93 genes validados por qRT-PCR, se confirmó que 35, además de mantener la significación, al ser analizados mediante un modelo jerárquico no supervisado, para clasificar las muestras según la expresión de estos genes, eran capaces de discriminar los distintos perfiles de respuesta al polen de olivo, con una buena sensibilidad y especificidad. Conclusiones: Los resultados de la respuesta humoral, junto al descenso de TGF-β, FOXP3 y células reguladoras en los sujetos alérgicos al polen de olivo durante la polinización, sugieren un descenso de sus mecanismos reguladores, así como, una recuperación de estos, mediante la inmunoterapia específica. El estudio diferencial de expresión génica masiva y su posterior validación por qRT-PCR, ha permitido definir un perfil de expresión de 35 genes, capaz de realizar una buena clasificación clínica entre los cuatro grupos de pacientes analizados y el grupo control de sujetos sanos. Estos genes, podrían ser útiles como futuras herramientas de mejora para el diagnóstico y el tratamiento de la alergia. Además, se han encontrado genes que nunca antes han sido relacionados con enfermedades alérgicas.Background: The reason why exposure to common environmental antigens induces allergic diseases in some people and not others remains undetermined. Different molecular mechanisms may modulate sensitization and natural or induced tolerance to allergens. Objective: To search for differential molecular mechanisms in the olive pollen allergic response in an area with extremely high antigenic load during the pollen season. Methods: The study population comprised 84 subjects clinically classified in 5 groups: Group 1, non-allergic; Group 2, asymptomatic, sensitized to olive pollen; Group 3, allergic other than olive pollen; Group 4, allergic to olive pollen (without treatment); and Group 5, allergic to olive pollen treated with specific immunotherapy. Sera and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained during and outside the pollen season. Serum levels of total IgE, olive pollen-specific IgE, IgA, and IgG4 antibodies and Th1, Th2, Th17, and Treg cytokines were analyzed. FOXP3 mRNA expression was determined in RNA extracted from PBMCs and the presence of regulatory T cells was analyzed by confocal microscopy in unfixed PBMCs. Whole-genome expression profile in peripheral blood cells of the five groups in situations of both high and low exposure was analyzed by microarray technology. Ninety-three transcripts of the most representative and statistically significant genes in the gene-expression and biological analyses among the five groups, were validated by qRT-PCR in different subjects selected with the same criteria. Results: Asymptomatic subjects showed the highest total IgE levels. The major difference found between untreated and treated patients was the highest levels of non-inflammatory antibodies (IgG4) in patients with treatment. The main result of cytokine analyses was the statistically significant decrease in TGF-β levels in untreated olive pollen allergic subjects (pollen season) compared with treated patients. This result correlated with the significant decreases in FOXP3 mRNA expression and the lower presence of regulatory T cells in PBMCs in the untreated olive pollen allergic patients during pollen season. The results of gene expression profiling obtained by Principal Component Analysis (PCA) showed five clusters of samples that correlated with the five clinical groups. The analysis of differential gene expression revealed differential genes and pathways in the five groups, and in general, the greatest differences were found among allergic groups and controls. Moreover, 35 of the 93 genes reanalyzed by qRT-PCR were confirmed as being differentially expressed. These 35 genes permit to discriminate, with a specificity reaching the 90%, the 4 clinical groups from healthy controls by an unsupervised hierarchical model. Conclusions: The results found in antibody, cytokine, mRNA levels and presence of regulatory cells point to a decrease in the cellular regulatory mechanisms mediated by TGF-β and FOXP3 in olive-pollen allergic patients that could be restored after specific-immunotherapy. The massive gene study shows how a good clinical classification permits the clustering of five clinical conditions according to gene expression. The study has validated several genes/pathways that play an important role in allergy pathogenesis and identified novel genes/pathways which could be relevant in this and other allergic diseases. Finally, a possible molecular signature has been found for olive pollen allergy which could be useful for the diagnosis and treatment of this and other sensitizations