Función oncogénica del inhibidor de la H+-ATP sintasa, IF1: desarrollo y caracterización de modelos transgénicos condicionales y tejido-específicos

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 23-04-2014IF1 es una pequeña proteína mitocondrial con una actividad regulada por pH que interacciona con la H+-ATP sintasa bloqueando su mecanismo de catálisis cuando la enzima se encuentra funcionando en modo reverso, translocando H+ al espacio intermembrana e hidrolizando ATP. En este estudio se demuestra por primera vez que IF1 es capaz de inhibir la síntesis de ATP de la H+-ATP sintasa ya que su sobre-expresión en células de mamífero produce un aumento del flujo glucolítico y del ΔΨm y una reducción de la respiración sensible a oligomicina (RSO). Por el contrario, su silenciamiento disminuye el flujo glucolítico y aumenta la RSO. Es decir, IF1 es un regulador clave del metabolismo energético de la célula. Además, IF1 se encuentra diferencialmente expresado en distintos tipos celulares y tejidos murinos y humanos. Los tumores humanos de mama, colon y pulmón presentan unos niveles significativamente elevados de IF1 respecto a los correspondientes tejidos normales. Sorprendentemente, un nivel bajo de expresión de IF1 es un marcador pronóstico de supervivencia libre de enfermedad que correlaciona con un mayor riesgo de aparición de metástasis. De cualquier manera, IF1 es una proteína esencial para el mantenimiento del fenotipo metabólico del cáncer. En el contexto de la regulación metabólica, la sobre-expresión de IF1 o su forma mutante H49K permite generar modelos murinos de patologías que cursan con una disfunción de la OXPHOS. El mutante de IF1, H49K, que carece de regulación por pH, es idóneo para estudiar la inhibición de la H+-ATP sintasa en tejidos con un elevado contenido endógeno de IF1 como es el caso del hígado. Se han generado ratones transgénicos tet-O-IF1 y tet-O-H49K que expresan la proteína transgénica humana IF1 o H49K de forma tejido-específica y regulada por doxiciclina. En concreto, se ha caracterizado un modelo de interferencia con la OXPHOS hepática mediada por la sobre-expresión condicional de H49K. En este modelo se demuestra, in vivo, que H49K inhibe la actividad sintasa de la ATPasa. El contenido hepático de ATP de los ratones que sobre-expresan este inhibidor está disminuido, con una consecuente activación de AMPK. Además, sus mitocondrias hepáticas muestran una respiración disminuida y con un defecto secundario en la actividad del complejo IV. Estos ratones presentan alteraciones metabólicas sistémicas como es la reducción de la glucemia y la lactacidemia. La inducción de hepatocarcinogénesis con N-dimetilnitrosamina (DEN) produce un mayor número de tumores en los ratones que sobre-expresan H49K, poniendo de manifiesto que la limitación de la OXPHOS favorece la transformación tumoral, apoyando el papel de IF1 en cáncer. En conclusión, IF1 se comporta como un regulador de la OXPHOS que contribuye a perfilar el metabolismo energético de la célula. Los ratones transgénicos generados permitirán estudiar el efecto de la inhibición de la síntesis de ATP mitocondrial en distintos tejidos como modelo de distintas patologías mitocondriales. Los resultados aquí mostrados aportan, además, nuevas evidencias de la participación de la inhibición de la H+-ATP sintasa en cáncer.IF1 is a small mitochondrial pH-regulated protein that interacts with H+-ATP synthase blocking its catalytic mechanism when the enzyme is working in reverse, translocating H+ to the intermembrane space and hydrolyzing ATP. This work demonstrate, for the first time, that IF1 is able to inhibit the synthesis of ATP by the H+-ATP synthase since its overexpression in mammalian cells increases the glycolytic flux and the ΔΨm and reduces the oligomycin sensitive respiration (OSR). Conversely, IF1 silencing reduces the glycolytic flux and increases OSR. Therefore, IF1 is a key regulator of energy metabolism of the cell. Moreover, IF1 expression is largely variable between different cell types and human and mouse tissues. Breast, colon and lung tumors express a significantly higher amount of IF1 compared to their normal tissue counterparts. Surprisingly, a low expression of IF1 is a marker of bad prognosis that correlates with a higher risk of metastasis. In any case, IF1 is an essential protein in the maintenance of the metabolic phenotype of cancer. In the context of metabolic regulation, the overexpression of IF1 or of its mutant H49K offers valuable tools to enable the generation of murine models to emulate pathologies based on OXPHOS deficiencies. H49K is an IF1 mutant that is not regulated by pH and, thus, it is especially suitable for studying the inhibition of the H+-ATP synthase in tissues with high endogenous content of IF1, as it is the case of liver. The generated transgenic mice tet-O-IF1 and tet-O-H49K express the human transgenic proteins IF1 or H49K in a tissue-specific and doxycycline-dependent manner. Specifically, this work describes a model of OXPHOS interference in liver via conditional overexpression of H49K. This transgenic model demonstrates that H49K inhibits the synthase activity of the ATPase in vivo. Liver ATP content of mice overexpressing H49K is diminished and, consequently, AMPK is activated. Moreover, liver mitochondria display a reduced respiration concomitant with a secondary impairment of complex IV activity. These mice show metabolic defects like a decreased blood glucose and lactate concentration. The hepatocarcinogenic agent N-diethylnitrosamine (DEN) induces a higher number of tumors in mice that overexpress H49K, evidencing that OXPHOS impairment favors tumor transformation, emphasizing the involvement of IF1 in cancer. Summarizing, IF1 behaves as an OXPHOS regulator that contributes to define energy metabolism of the cell. The transgenic mouse models here described make possible to study the effect of the inhibition of mitochondrial ATP synthesis in different tissues, hence helping to model different mitochondrial pathologies related to OXPHOS defects. Moreover, the results of this work provide new evidences of the participation of the H+-ATP synthase in cancer