Knock-in gene correction of induced pluripotent stem cells from pyruvate kinase deficient patient

Tesis doctoral inédita. Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 27-11-2013La Deficiencia en Piruvato Quinasa (DPQ) es una enfermedad rara causada por mutaciones en el gen PKLR que provoca Anemia Hemolítica no Esferocítica Crónica (AHNEC). El único tratamiento definitivo para los casos graves de DPQ es el Trasplante Alogénico de Médula Ósea (TAMO). Debido a los riesgos asociados a TAMO, como la enfermedad de injerto contra huésped, y la baja disponibilidad de donantes adecuados, hacen que la terapia celular autóloga sea una alternativa atractiva para el tratamiento de los casos graves de DPQ. Una alternativa prometedora para el tratamiento de trastornos hereditarios hematopoyéticos es la combinación de la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a partir de muestras de pacientes, junto con la corrección especifica de sitio mediada por Recombinación Homóloga (RH). Con el fin de evaluar esta posibilidad como alternativa terapéutica para DPQ, hemos generado iPSC derivadas de Células Mononucleares de sangre periférica (CMN) de pacientes con DPQ (DPQiPSCs) mediante vectores virales basados en el virus Sendai y las hemos corregido mediante RH específica de sitio asistida por dos tipos de nucleasas de ADN, Meganucleasas (MG) y TALE nucleasas (TALENTM). Para ello, hemos seguido una estrategia de Knock-in en el locus PKLR. Se obtuvieron diferentes clones de hiPSC a partir de dos pacientes de DPQ y un donante sano, de los cuales se confirmó la pluripotencia y la desaparición de los vectores de reprogramación. Con el fin de evitar la reprogramación de células linfoides, se llevó a cabo una estrategia basada en el uso de citoquinas, verificándose mediante el análisis de reordenamientos somáticos genómicos característicos de linfocitos B y T. Es importante señalar que la diferenciación eritroide de DPQiPSCs es deficiente tal como ocurre en los pacientes con DPQ, manifestando una acumulación de células eritroides inmaduras positivas para los marcadores CD71 y CD235a, lo que confirma el potencial uso de hiPSC para el modelado de enfermedades. Con el fin de restaurar el defecto genético, se han utilizado MG y TALENTM para facilitar la introducción de parte del ADNc de RPK terapéutico en el intrón 2 del gen PKLR. La MG presentó una muy baja especificidad para el gen PKLR, sin embargo, después del uso de PKLR1 TALENTM, se consiguió una correcta integración en un alto porcentaje de clones analizados mediante PCR y Southern Blot, así como la presencia de la proteína terapéutica RPK recombinante. Sorprendentemente, debido a la presencia de un polimorfismo en un único nucleótido en el ADN genómico de uno de los pacientes, se detectó exclusivamente integración específica en uno de alelos. Se examinó la integridad del genoma mediante el análisis de mutaciones somáticas y de Variaciones de Número de Copia (VNC), detectándose tres mutaciones y seis VNC en la muestra de DPQiPSC corregida, que no estaban presentes en la muestra de CMN de sangre periférica original. Estas modificaciones no afectan a ningún gen que confiera ninguna ventaja selectiva durante el cultivo de hiPSC ni al uso de nucleasas. Por último, cabe destacar que las células DPQiPSC corregidas, una vez diferenciadas a al linaje eritroide, muestran un perfil de maduración normal, similar al observado en las hiPSCs de CMN de un donante sano. Como conclusión, los resultados presentados muestran la posibilidad de generar eritrocitos genéticamente corregidos específicamente en el locus PKLR, a partir de hiPSC de pacientes de DPQ.Pyruvate Kinase Deficiency (PKD) is a rare disease caused by mutations in the PKLR gene that leads to Chronic Non-Spherocytic Hemolytic Anemia (CNSHA). The only definitive treatment for severe cases of PKD is allogeneic Bone Marrow Transplantation (BMT). The risks associated to BMT, such as graft versus host disease, together with the low availability of suitable donors, make autologous cell therapy desirable for this disease. Patient specific induced Pluripotent Stem Cells (hiPSC) coupled with targeted gene correction via Homologous Recombination (HR), is a promising alternative for the treatment of hematopoietic inherited disorders. In order to prove the feasibility of this therapeutic alternative for PKD, we have generated integration free iPSCs from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PB-MNC) of PKD patients (PKDiPSCs) using Sendai based viral vectors, and have corrected them through a Knock-In approach in the PKLR locus by using two types of DNA nucleases, Meganucleases (MG) and TALE nucleases (TALENTM). Different hiPSC clones were obtained from two patients and one healthy donor; these hiPSC clones showed pluripotent characteristics even after the disappearance of reprogramming vectors. A strategy to avoid lymphoid cells reprogramming within PB-MNC was successfully applied as neither T nor B cell receptor rearrangements were found in any of the analyzed hiPSC lines. Interestingly, erythroid differentiation of PKDiPSC was impaired as occurs in PKD patients, showing an accumulation of immature CD71/CD235a double positive erythroid cells and assessing the use of hiPSC for disease modeling. To restore the genetic defect, specific MG and TALENTM were used to facilitate the Knock-In of a codon optimized RPK cDNA in the second intron of the PKLR gene. Whereas the MG generated DSB with very low specificity, after using the PKLR1 TALENTM, correct integration in PKLR locus was confirmed by PCR and southern blot, and the presence of the recombinant therapeutic RPK was assessed at the protein level. Surprisingly, allele specific integration due to the presence of a single nucleotide polymorphism was identified in one of the patients, pointing out its potential use in specific allele substitution. Genome integrity was examined by analyzing the appearance of de novo somatic mutations and Copy Number Variations (CNVs), detecting three single nucleotide variants and six CNVs in the corrected PKD2iPSC. The majority of them were already present before correction but not in the PB-MNC. These modifications did not include genes that were clearly associated either to a selective advantage or to the use of the nucleases. More importantly, gene corrected coPKDiPSCs displayed a normal erythroid maturation profile, similar to the one observed in wild-type hiPSCs. Overall, we show the feasibility of PKLR locus specific gene correction in patient specific iPSCs