Obtención de una sonda de ARN para el diagnóstico del virus del mosaico del pepino dulce (PepMV) mediante hibridación molecular: seguimiento epidemiógico de la virosis en cultivos de tomato de la Región de Murcia

El Virus del Mosaico del Pepino Dulce (PepMV) detectado en Europa en 1999, está causando importantes daños en las principales zonas productoras de tomate del Sureste Español. Se transmite mecánicamente de forma eficiente, lo que ha promovido su rápida expansión. Es por esto que, tras su aparición en la Región en el año 2000, se hizo preciso un método de diagnóstico rápido y eficaz. La técnica hibridación molecular ha sido puesta a punto para el seguimiento de la virosis en los cultivos de tomate de la Región. El primer objetivo fue la obtención de una sonda de ARN específica para su detección. El trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de virología del CSIC de la Estación Experimental La Mayora, en Málaga, bajo la dirección del Dr. M. A. Aranda. A partir del ARN de plantas de Nicotiana benthamiana inoculadas con un aislado de PepMV, conseguimos amplificar un fragmento del ADN viral de unos 600 nucleótidos, mediante la técnica Transcripción Inversa-PCR (RT-PCR) y usando cebadores específicos. Los cebadores fueron diseñados sobre la única secuencia parcial del PepMV, de 584 nucleótidos, publicada hasta el año 2001. Este fragmento fue ligado al plásmido pGEM-T y clonado en Escherichia coli. A partir del fragmento clonado se desarrolló la sonda de ARN mediante una digestión con la enzima de restricción ECO RI y posterior transcripción con la enzima SP6 RNA polimerase. El marcaje de la sonda para su detección radiográfica se realizó en la reacción de transcripción usando UTPs marcados con digoxigenina. Una vez desarrollada la sonda, se puso a punto la técnica de hibridación molecular para el diagnóstico del virus y fue llevado a cabo un seguimiento de la enfermedad en cultivos de tomate de la Región. Este trabajo fue realizado en el Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agroalimentario (IMIDA), en La Alberca (Murcia), bajo la dirección del Dr. J. L. Cenis Anadón. Durante las campañas de verano 2001 y otoño-invierno 2001/02, se prospectaron varios cultivos de tomate, al aire libre, bajo malla y bajo invernadero, en diferentes zonas costeras del término municipal de Mazarrón y Lorca con características productivas diferentes. Los seguimientos se realizaron cada dos semanas desde el comienzo del cultivo hasta que éste se dio por concluido, tomando muestras al azar en cada parcela, mediante la impresión de peciolos sobre una membrana de nylon positivamente cargada, in situ, para su análisis en laboratorio por el método de hibridación molecular. Se vio que en los cultivos de verano (2001), tanto al aire libre como bajo malla, la enfermedad no aparecía hasta los meses de septiembre y octubre, con una incidencia que no superó en la mayoría de las parcelas el 35%. En la campaña de otoño-invierno 2001/02, las primeras manifestaciones del virus se dieron en los meses de noviembre y diciembre, al principio del cultivo, con un 5-65% de plantas afectadas según parcelas. La enfermedad se extendió a lo largo del ciclo de cultivo rápidamente, hasta afectar a todo el invernadero en los meses de abril y mayo. Se analizaron separadamente plantas injertadas y no injertadas, resultando que el virus aparecía entre 15 y 20 días antes en las injertadas, que además alcanzan el 100% de infección antes que las plantas sin injertar. También fueron analizadas diferentes especies de malas hierbas asociadas al cultivo, encontrándose el virus en Amaranthus blitoides, Conyza bonariensis, Chenopodium album, Cyperus rotundus, Sisymbrium irio, Malva parviflora y Solanum nigrum. Estas especies no están descritas en la bibliografía como hospedantes de PepMV, por lo que serían necesarios análisis con técnicas más sensibles para confirmar estos resultados. [ENG] Pepino mosaic virus was detected in Europe in 1999 and it is causing important damages in the tomato-growing areas of the southeastern Spain. It is efficiently mechanically transmitted, which has favored its rapid expansion. After its detection in Murcia in 2000, it was necessary to develop a method to evaluate the virus incidence in the tomato crops. The first objective of this project was to obtain an RNA probe that was specific for the detection of this virus. It was carried out in the virology laboratory of the CSIC, ‘Estación Experimental La Mayora’, in Málaga, under the direction of Dr. M.A. Aranda. Nicotiana benthamiana plants were inoculated with a PepMV isolate from Murcia, and RNA was isolated from them. Using this RNA and specific primers, a cDNA containing about 600 nt was generated by RT-PCR. The primers were designed based on the unique PepMV partial sequence of 584 nt available in 2001. This cDNA was cloned in Escherichia coli using the plasmid pGEM-T as vector. An RNA probe was synthesized from the clone after it was digested with the restriction enzyme ECO RI and transcripted using the SP6 RNA polymerase. The probe was labeled using UTPs labeled with digoxigenin.After obtaining the probe, the molecular hybridization technique was optimized for the diagnostic of PepMV and a study of the disease in several tomato crops in Murcia was carried out. This work was done at the IMIDA (Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agroalimentario) in Murcia, under the direction of Dr. J.L. Cenis. During the summer cycle in 2001 and autumn-winter cycle in 2001/2002, several tomato crops grown in open field and under net and plastic greenhouses, were prospected in different coastal areas of Mazarrón and Lorca with different production characteristics. Samplings were done every 2 weeks from the beginning to the end of the crop cycle. The samples were randomly collected and the petioles were cut and impressed in situ in a nylon membrane positively charged. Then, samples were analyzed by molecular hybridization in the lab. In the summer plantings, the disease appeared in September and October, with an incidence lower than 35% in most of the crops. In the autumn plantings, the virus appeared in November and December, at the beginning of the cultures, with a 5-65% of affected plants. The disease expansion was very fast and a 100% level of infection was found in April and May. Grafted and no grafted plants were analyzed separately and it was observed that PepMV appeared 15 to 20 days before in the grafted plants which reached a 100% level of infection faster than no grafted plants. Some weeds species associated to these crops were also analyzed and the virus was found in Amaranthus blitoides, Conyza bonariensis, Chenopodium album, Cyperus rotundus, Sisymbrium irio, Malva parviflora y Solanum nigrum. But most of these species are not described as PepMV hosts in the literature, so these results must be confirmed by other more sensitive analysisEscuela Técnica superior de Ingeniería Agronómic