Detección y caracterización de péptidos con actividad antimicrobiana en aislados de Staphylococcus. Aplicación al ámbito agroalimentario y en salud pública

Bacteriocins have been considered an effective tool to address the problem of antibiotic resistance. Staphylococcus is normally found as commensal microorganisms of the nasal and skin microbiota of animals and humans, although some species can be opportunistic pathogens, especially S. aureus. Currently, Staphylococcus is gaining attention as a bacteriocin-producing genus, especially coagulase-negative species. In this work, the antimicrobial activity (AA) of 1205 staphylococcal isolates, both coagulase-positive (CoPS, n=284) and -negative (CoNS, n=921), from 5 different origins and 29 different species against indicator bacteria of public health and food safety relevance, including multi-resistant (MDR) and zoonotic bacteria, were by the spot-on-lawn method. Thus, 92 antimicrobial-producing staphylocci (Bac+ isolates) were detected from various sources (nº of producing isolates/nº of tested isolates): humans (24/83), wild-life animals (34/662), pets (15/50), food (17/278) and environment (2/132). Notably, AA was only detected against Gram-positive (G+) indicator bacteria. Then, 37 Bac+ staphylococci were selected for characterisation based on their species, origin, phenotypic/genotypic characteristics, and inhibitory activity profile. AA was assessed in cell-free supernatants (CFS) and butanol extracts (BT). Nine out of 37 (24%) staphylococci showed AA in CFS while more than 90% of BT extracts revealed AA against at least one of the indicators tested. Moreover, the bacteriocin micrococcin P1 (MP1) was identified by whole genome sequencing (WGS) and mass spectrometry, in 3 CoNS recovered from meat and water, from species infrequently implicated in infections (2 S. sciuri, 1 S. hominis) and 1 SCoP (S. aureus) from surface water. This bacteriocin showed high activity (both in CFS and BT) against indicators of many different genera and species of G+ bacteria, some of them of great relevance in biomedicine, veterinary medicine, and food safety. In addition, relevant bacteriocins mainly lanthipeptides were detected including epilancin 15X, BSA and bacCH91 (previously described in the literature) and other unknown lanthipeptides identified in three CoNS isolates from food. On the other hand, WGS studies allowed the detection of Class II bacteriocin gene clusters such as bacSp2222 (2 S. pseudintermedius, 1 human/1 dog), lactococcin 972 present in high frequency in this collection; circular bacteriocins in 3 producing isolates (2 CoNS and 1 CoPS) and lugdunin, a non-ribosomal antimicrobial peptide detected in 2 S. lugdunensis isolates (recovered from human). As for MP1-producing staphylococci, it is to highlight the antimicrobial activity detected against methicillin-resistant S. aureus (MRSA) both in competition studies as well as their MP1-prepurified extracts (BT), which showed potent inhibitory and bacteriostatic activity in liquid medium and in combination with antibiotics (synergy with clindamycin, oxacillin, and chloramphenicol) has been demonstrated. On the other hand, the potential of antimicrobial-producing staphylococci in the modulation of the nasotracheal microbiota has been evaluated using the stork model. For this purpose, the AA of the Staphylococcus was analysed against the G+ isolates present in the same sample and against a representative collection of G+ bacteria from the nasotracheal microbiota of storks. It is worth mentioning the detection of 9 isolates, especially CoNS (n=7), which are of great interest due to their AA and their potential for microbial modulation. Although further characterisation and bacteriocin purification is necessary, this work opens the door to the interest of CoNS isolates producing bacteriocins or extracts in the modulation of the nasal microbiota as a novel application in the prevention of diseases caused by relevant pathogens such as MRSA. Finally, in this thesis, the antimicrobial activity of 15 bacteriocin-producing staphylococcal isolates was studied against 27 pathogenic microorganisms used as indicators and distributed in categories based on their potential areas of application: a) mastitis and dairy industry; b) poultry pathogens and zoonotic agents; c) swine zoonoses; d) food safety; e) aquaculture; f) wine industry; and g) mushroom cultivation. These studies showed potent AA against G+ indicators (60% of the indicators were inhibited) while no inhibitory capacity was detected against G- indicators. It is worth noting the increase observed in the AA of the BT extracts, compared with Spot-on-lawn and CFS, both considering the percentage of inhibited indicators and the intensity of the halos. On the other hand, possible bacterial combinations have been identified for synergic applications against a specific pathogen. Based on all the above, the results of hemolysis, gelatinase activity, antibiotic resistance and virulence of the bacteriocin-producing staphylococcal isolates included in this work, the three MP1-producing CoNS isolates can be proposed as potential candidates for future applications.Las bacteriocinas son objeto de estudio en la búsqueda de herramientas efectivas frente a la problemática de la resistencia a los antibióticos. Staphylococcus es un género bacteriano que incluye microorganismos comensales de la microbiota nasal y de la piel de animales y personas, aunque algunas especies también pueden ser patógenos oportunistas, especialmente S. aureus. Su interés como microorganismo productor de bacteriocinas está cobrando especial interés en los últimos años, sobre todo en especies coagulasa negativas. En esta tesis se ha evaluado la actividad antimicrobiana (AA) de 1205 cepas de estafilococos, tanto coagulasa-positivos (SCoP, n=284) como -negativos (SCoN, n=921), de 5 orígenes y 29 especies diferentes frente a bacterias indicadoras de relevancia en salud pública y seguridad alimentaria, incluyendo bacterias multiresistentes (MDR) y zoonóticas, por el método "spot-on-lawn". Se han detectado 92 cepas de estafilococos de diversos orígenes con AA (Nº cepas productoras/Nº cepas evaluadas): humanos (24/83), animales de vida libre (34/662), mascotas (15/50), alimentos (17/278) y medio ambiente (2/132). Cabe destacar que solo se detectó AA frente a bacterias indicadoras Gram-positivas (G+). Se seleccionaron 37 estafilococos productores (cepas Bac+) para su caracterización en base a su especie, origen, características fenotípicas/genotípicas y su perfil de actividad inhibitoria. Se evaluó la AA en sobrenadantes libres de células (SLC) y en extractos obtenidos con butanol (BT). Nueve de los 37 (24%) estafilococos presentaron AA en los SLC mientras que más del 90% de los extractos BT reflejaron AA frente al menos uno de los indicadores analizados. Por medio de secuenciación masiva del genoma (WGS) y espectrometría de masas se identificó la bacteriocina micrococcina P1 (MP1) en cuatro cepas, 3 SCoN recuperados de carne y agua, de especies infrecuentemente implicadas en infecciones (2 S. sciuri, 1 S. hominis) y 1 SCoP (S. aureus) procedente de agua superficial. La bacteriocina MP1 presentó gran actividad (tanto en SLC como en BT) frente a cepas de muchos géneros y especies diferentes de bacterias G+, algunas de ellas de gran relevancia en biomedicina, veterinaria y seguridad alimentaria. Asimismo, se identificaron otras bacteriocinas relevantes (principalmente lantibióticos), como epilancina 15X, BSA y bacCH91 (previamente descritos en la bibliografía) y bacteriocinas desconocidas potencialmente lantibióticos en tres aislados de SCoN procedentes de alimentos. En cuanto a los estudios por WGS, se detectaron genes codificantes de bacteriocinas de Clase II tales como bacSp2222 (2 S. pseudintermedius, 1 humano/1 perro), lactococcina 972 presente en gran frecuencia en esta colección; bacteriocinas circulares en 3 cepas productoras (2 SCoN y 1 SCoP) y lugdunina, péptido antimicrobiano no-ribosomal detectado en 2 cepas de S. lugdunensis (de origen humano). Atendiendo a los estafilococos productores de MP1, cabe destacar su gran actividad antimicrobiana frente a S. aureus resistente a meticilina (SARM) confirmada en estudios de competencia, así como de sus extractos MP1-prepurificados donde se ha evidenciado su potencial inhibitorio y bacteriostático en medio líquido y en combinación con antibióticos (sinergia con clindamicina, oxacilina y cloranfenicol). Por otro lado, se ha evaluado la posible modulación de la microbiota nasotraqueal por estafilococos con AA utilizando el modelo de cigüeña. Para ello, se ha analizado la AA de los estafilococos detectados en la microbiota nasotraqueal de estos animales frente a los aislados G+ presentes en la misma muestra y frente a una colección representativa de bacterias G+ de la microbiota nasotraqueal de cigüeñas. Cabe destacar la detección de 9 aislados Bac+, especialmente SCoN (n=7), con elevado interés por su AA y su potencial en la modulación microbiana. Si bien es necesario profundizar en la caracterización y purificación de las bacteriocinas detectadas, estos trabajos abren la puerta al interés de las cepas SCoN productoras de bacteriocinas o extractos de las mismas en distintas aplicaciones, especialmente en la modulación de la microbiota nasal como una novedosa aplicación en la prevención de enfermedades causadas por agentes patógenos de interés, como es el caso de SARM. Finalmente, en esta tesis se ha estudiado la actividad antimicrobiana de 15 de las cepas de estafilococos productoras de bacteriocinas frente a 27 microorganismos patógenos adicionales utilizados como indicadores y distribuidos en categorías en base a sus potenciales áreas de aplicación: mastitis e industria láctea, patógenos aviares y agentes zoonóticos, zoonosis porcinas, seguridad alimentaria, acuicultura, industria vitivinícola y cultivo de hongos. Estos estudios evidenciaron la potente AA frente a indicadores G+ (60% de los indicadores inhibidos) mientras que no se detectó capacidad inhibitoria frente a los indicadores G-. Cabe destacar la mayor AA detectada en los extractos BT comparada con la identificada en spot-on-lawn y en los SLC, tanto en el porcentaje de indicadores inhibidos como en la intensidad de los halos. Por otro lado, se han identificado posibles consorcios bacterianos para su aplicación conjunta frente a un determinado patógeno. Con todo ello y teniendo en cuenta los resultados de hemólisis, actividad gelatinasa, resistencia a antibióticos y virulencia de las cepas de estafilococos Bac+ incluidas en este trabajo, se proponen las cepas productoras de la MP1 (especialmente las 3 SCoN) como potenciales candidatas a estudio para aplicaciones futuras