Efficient CRISPR/Cas9 genome editing in alfalfa using a public germplasm

Because its ability to acquire large amounts of nitrogen by symbiosis, tetraploid alfalfa is the main source of vegetable proteins in meat and milk production systems in temperate regions. Alfalfa cultivation also adds fixed nitrogen to the soil, improving the production of non-legumes in crop rotation and reducing the use of nitrogen fertilizers derived from fossil fuel. Despite its economic and ecological relevance, alfalfa genetics remains poorly understood, limiting the development of public elite germplasm. In this brief article, we reported the high-efficiency of alfalfa mutagenesis by using the public clone C23 and the CRISPR/Cas9 system. Around half of the GUS overexpressing plants (35S-GUS under C23 genomic background) transformed with an editing plasmid containing two sgRNAs against the GUS gene and the Cas9 nuclease exhibited absence of GUS activity. Nucleotide analysis showed that the inactivation of GUS in CRISPR/Cas9-editing events were produced via different modifications in the GUS gene, including frameshift and non-sense mutations. Using the CRISPR/Cas9 system and two sgRNAs, we have also edited the alfalfa gene NOD26, generating plants with different doses of alleles at this locus, including complete gene knockout at high efficiency (11%). Finally, we discuss the potential applications of genome-editing technologies to polyploid research and to alfalfa improvement public programs.Instituto de BiotecnologíaFil: Bottero, Ana Emilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Bottero, Ana Emilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Bottero, Ana Emilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Massa, Gabriela Alejandra. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; ArgentinaFil: González, Matías Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: González, Matías Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Stritzler, Margarita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Tajima, Hiromi. University of California, Davis. Department of Plant Sciences; Estados UnidosFil: Gomez, Maria Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Gomez, Maria Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Gomez, Maria Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Frare, Romina Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Frare, Romina Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Frare, Romina Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce. Instituto de Innovación para la Producción Agropecuaria y el Desarrollo Sostenible (IPADS); ArgentinaFil: Feingold, Sergio Enrique. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Blumwald, Eduardo. University of California, Davis. Department of Plant Sciences; Estados UnidosFil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Ayub, Nicolás Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentin