Die Rolle von Phosphodiesterase 2 in der Herzfrequenz-Regulation und im Angiotensin-induziertem kardialen Remodeling

Hintergrund: Die Herzinsuffizienz ist ein internistisches Krankheitsbild, welches weltweit eines der höchsten Morbiditäten und Mortalitäten aufweist. Trotz etablierter Behandlungsmethoden sterben mehr als die Hälfte der Patienten innerhalb der ersten fünf Jahren nach Diagnosestellung. Zur pharmakologischen Therapie gehören in erster Linie die Betablocker, welche durch kompetitive Hemmung am β- Adrenorezeptor die β- Signalkaskade und somit die sympathische Wirkung am Herzen reduzieren. Gleichzeitig wird durch die Hemmung die Anzahl an β- Adrenorezeptoren erhöht, wodurch die Rezeptorsensitivität insgesamt herabgesetzt wird. Zudem verhindern sie ein Remodeling der Ventrikel, führen zu einer verbesserten myokardialen Energie- und Calciumnutzung, sowie zu einer Reduzierung von kardialen Arrhythmien. Aufgrund ihres Nebenwirkungsspektrums - Hypotonie, Bradykardie und erektile Dysfunktion - tolerieren nur wenige Patienten eine wirksame Dosis des Medikamentes. Fragestellung: Die Phosphodiesterasen stellen einen von mehreren Regulatoren der β-Signalkaskade dar, indem sie deren Second Messenger cAMP hydrolysieren und die Sympathikusaktivierung drosseln. In vorangegangenen Studien im Menschen ist die PDE2 bei einer Herzinsuffizienz hochreguliert. Gleichzeitig bildet die PDE2 eine Verbindung zum NO – sGC – cGMP – Signalweg, da sie als einzige PDE von cGMP allosterisch aktiviert werden kann und infolgedessen vermehrt cAMP hydrolysiert. PDE2 ist ein entscheidendes Enzym im negativen cross talk von der cAMP und cGMP Signalkaskade. Diese Arbeit untersucht die Funktion der PDE2 in der chronischen Herzinsuffizienz. Inwieweit zeigen sich vermehrt Rhythmusstörungen bei einem Mausgenotyp, dessen PDE2 überexprimiert vorliegt, im Gegensatz zum Wildtyp? Wie reagiert die transgene Maus auf adrenergen Stress? Und abschließend, schützt eine überexprimierte PDE2 vor einer Angiotensin II- induzierten kardialen Hypertrophie? Methoden: Nach Genotypisierung der Mäuse mit Hilfe von PCR Testung der Schwanzspitzen konnte mittels transthorakaler Echokardiographie die Morphologie des Herzens (Durchmesser der Ventrikelwand und des Ventrikels selbst) festgestellt und somit die Herzleistung (Ejektionsfraktion, systolisches und diastolisches Volumen) und das Herzgewicht errechnet werden. Zur dauerhaften Ableitung der Herzaktivität wurden den Mäusen (n = 7) pectoral telemetrische Transmitter implantiert, um die Herzfrequenzvariabilität und Arrhythmien (Salven, Extrasystolen, ventrikuläre Tachykardien) abzuleiten. Zur Arrhythmieprovokation wurde den Mäusen (n = 4) Ivabradin und Isoproterenol intraperitoneal verabreicht. Zur Provokation einer Kardiohypertrophie erhielten die Wildtyp (WT, n = 9) und transgenen Mäuse (TG, n = 10) mittels einer im zerviko-thorakalen Rückenbereich implantierten osmotischen Minipumpe für 14 bzw. 28 Tage Angiotensin II. Die Herzparameter zur Messung einer Hypertrophie wurden mittels transthorakaler Echokardiographie alle 7 Tage für maximal 28 Tage erfasst. Zudem wurden die Herzgewichte nach Tötung der Mäuse mittels vorausgehender Isoflurannarkose und anschließendem Genickbruch durch sofortiges Wiegen der Organe erlangt. Verglichen wurden die Ergebnisse der für 14 und der für 28 Tage dem Angiotensin II ausgesetzten Tieren. Post mortem wurden die Herzen der Mäuse nach Trennung der Ventrikel von den Vorhöfen kryokonserviert und das Ventrikelgewebe zur proteinchemischen Analyse mechanisch aufgeschlossen. Der zentrifugierte Überstand wurde für die Proteinbestimmung nach Bradford zur Erlangung der Proteinkonzentration verwendet. Im Anschluss erfolgte zur Größenselektion der Proteine eine Gelelektrophorese mit anschließendem Western Blotting zum Nachweis der Proteine. Zur Auswertung und Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden die Proteinlevel auf das Kardiomyozyten-spezifische Calsequestrin normiert. Ergebnisse: Bei überexprimierter PDE2 bestand eine grundsätzlich niedrigere Herzfrequenz mit erhaltender chronotroper Adaptionsfähigkeit und kompensatorisch erhöhter Kontraktilität. Zudem war bei den TG- Mäuse die Herzfrequenzvariabilität höher als bei den WT. Es zeigte sich kein Anhalt für eine Beeinflussung des HCN-Kanals durch die erhöhte PDE2. Bei vermehrter Stimulation der β-adrenergen Rezeptoren bestand kein signifikanter Unterschied in der Zunahme der Herzfrequenz, jedoch präsentierten sich deutlich weniger ventrikuläre Extrasystolen und Arrhythmien bei den TG- Mäusen als bei den WT- Mäusen. Bei den durch stete Ang. II-Applikation hypertrophierten Herzen stellte sich über die Zeit eine Zunahme der Herzfrequenz bei sowohl den WT- als auch den TG- Mäusen dar, bei gleichzeitig aufrecht erhaltener linksventrikulärer Funktion. Es zeigte sich ebenfalls bei beiden eine noch bestehende β-adrenerge Rezeptorsensibilität, vor allem bezüglich der Ejektionsfraktion. Von PKA- bzw. CaMKII-abhängige Zielproteine wiesen bei beiden Phänotypen keine vermehrte Phosphorylierung auf. Schlussfolgerung: Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die PDE2 als Cross Link zwischen der cGMP- und der cAMP-Signalkaskade bei Überexpression ähnlich wie ein Betablocker die Herzfrequenz reduziert ohne die Herzleistung zu beinträchtigen. Sie schützte vor Arrhythmien und zeigte bei einer Kardiohypertrophie dennoch eine bestehende β-adrenerge Rezeptorsensibilität. Ein Schutz vor einer kardialen Hypertrophie bei den PDE2- überexprimierten Mäusen konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Klinische Daten zeigen eine Hochregulation der PDE2 bei herzinsuffizienten Patienten. Ob eine Überstimulation der PDE2 in vivo und somit eine Zunahme der cAMP- Hydrolyse tatsächlich kardioprotektiv in der terminalen Herzinsuffizienz ist - oder sogar davor - bedarf noch weiterer Forschung.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Herzinsuffizienz 1 1.1.1 Epidemiologie 1 1.1.2 Ätiologie 2 1.1.3 Pathophysiologie 3 1.2 Behandlung der Herzinsuffizienz 4 1.2.1 Medikamentöse Behandlung 5 1.2.1.1 ACE-Hemmer und AT1-Antagonisten 5 1.2.1.2 Betablocker 5 1.2.1.3 Ivabradin 6 1.3 Wirkungen des vegetativen Nervensystems am Herzen 7 1.3.1 Physiologie der kardialen β-adrenergen Signalkaskade 7 1.3.2 Kompartimentierung in Kardiomyozyten 8 1.4 Physiologie der Phosphodiesterasen 9 1.4.1 Cyclisches Guanosinmonophosphat 9 1.4.2 Die Subtypen der Phosphodiesterasen 10 1.4.3 Die Interaktion von cGMP und cAMP 14 1.4.4 Die PDE2 in der Herzinsuffizienz 16 1.5 Vordaten 17 1.5.1 Überexpression von PDE2 im Mausmodell 17 1.6 Ziele dieser Arbeit 18 2 Material und Methoden 20 2.1 Herkunft und Gewinnung der Wildtyp- und transgenen Mäuse 20 2.1.1 Tierhaltung und Tötung 20 2.1.2 Genotypisierung der Mäuse 20 2.2 Echokardiographie zur Messung der kardiologischen Parameter 21 2.3 Einbau der telemetrischen Transmitter 24 2.4 Aufzeichnung des EKG 25 2.5 Einbau der osmotischen Minipumpen 25 2.6 Herzentnahme bei Mäusen 26 2.7 Proteinchemische Methode 26 2.7.1 Aufschluss des Herzgewebes zur proteinchemischen Analyse 26 2.7.2 Proteinbestimmung nach Bradford 27 2.7.3 SDS-PAGE 28 2.7.4 Transfer der Proteine auf Membranen (Westernblot) 29 2.7.5 Auftragen der Antikörper auf die Membranen 30 2.7.6 Aufnahmen 32 2.8 Statistische Auswertungen 32 3 Ergebnisse 33 3.1 Charakterisierung der Herzfunktion bei PDE2-Überexpression mittels EKG 33 3.1.1 Zirkadiane Messung der Herzfrequenz und Aktivität 33 3.1.2 Herzfrequenzvariabilität 35 3.1.3 Autonome Herzfunktion unter Ivabradin 36 3.1.4 Arrhythmieprovokation mit Isoproterenol 37 3.2 Die Rolle von PDE2 im Angiotensin II- induzierten kardialen Remodeling 41 3.2.1 Grundcharakterisierung der Herzfunktion bei niedriger PDE2- Überexpression mittels Echokardiographie 41 3.2.2 Auswirkung erhöhter PDE2-Spiegel nach chronischer Angiotensin II Applikation 43 3.3 Auswertung der Western Blots der PDE2A3-4808 Mäuse 49 4 Diskussion 54 4.1 Phosphodiesterase 2 reguliert die Herzfrequenz 54 4.2 Phosphodiesterase 2 schützt vor ventrikulären Arrhythmien 55 4.3 Phosphodiesterase 2 im kardialen Remodeling 56 4.4 Limitation der Überexpression durch zelluläre Kompartimentierung 58 4.5 Diskussion der Methodik und Bewertung der Ergebnisse 58 4.6 Ausblick: PDE2 als Downstream Target für Beta-Adrenorezeptor-Blockade? 59 5 Zusammenfassung/ Summary 61 5.1 Zusammenfassung 61 5.2 Summary 63 6 Anhang 66 6.1 Puffer 70 7 Literaturverzeichnis 72Background: Congestive heart failure is a medical condition, which has one of the highest morbidity and mortality rates worldwide. Despite having established treatments, more than half of the patients die within the five years after diagnosis. First-line pharmacological therapy includes beta-blockers. By competitive inhibition at the β-adrenoreceptor, they reduce the β-signal cascade and thus the sympathetic effect on the heart. Simultaneously, this inhibition increases the number of β-adrenoreceptors, which then reduces the sensitivity of the receptors. Additionally, beta-blockers prevent remodeling of the ventricles, lead to improved myocardial energy and calcium utilization, and reduce the risk of cardiac arrhythmias. Due to its side effects – such as hypotension, bradycardia, and erectile dysfunction – only few patients tolerate an effective dose of the drug. Hypothesis: Phosphodiesterases are one of several regulators of the β- signaling cascade. They hydrolyze their second messenger cAMP and reduce sympathetic activation. Previous studies in humans showed an upregulated PDE2 in heart failure. PDE2 is a special PDE, since it forms a connection between the β adrenergic and the NO – sGC – cGMP signaling pathway. It is the only PDE, which is activated by cGMP allosterically. As a result, PDE2 increasingly hydrolyzes cAMP. Therefore, PDE2 is a key enzyme in the negative cross talk of the cAMP and cGMP signaling cascade. This thesis investigates the function of PDE2 in chronic heart failure. Are there increased cardiac arrhythmias in mice, which have an overexpressed PDE2, in comparison to wild type mice? How do these mice react to adrenergic stress? And finally, does an overexpressed PDE2 protect against an Angiotensin II-induced cardiac hypertrophy? Methods: After genotyping the mice’s tail tips with the help of PCR tests, the morphology of the heart (diameter of the ventricular wall and the ventricle itself) could be determined with the help of transthoracic echocardiography. With this data, the cardiac output (ejection fraction, systolic and diastolic volume) and the heart weight were calculated. To record cardiac activity permanently, telemetric transmitters were implanted pectoral in the mice (n = 7), in order to gain heart rate variability and arrhythmia data (salvos, extrasystoles, ventricular tachycardias). To provoke the arrhythmia, mice (n = 4) were intraperitoneally administered ivabradine and isoproterenol. To provoke cardiac hypertrophy, the wild type (WT, n = 9) and transgenic mice (TG, n = 10) received angiotensin II using osmotic minipumps, implanted in the cervicothoracic back area for 14 or 28 days. The cardiac parameters for hypertrophy were measured using transthoracic echocardiography every 7 days, recorded for a maximum of 28 days. In addition, each heart was weighted immediately after killing the mice using isoflurane anesthesia and subsequent neck fracture. The results of the animals exposed to angiotensin II for 14 and 28 days were compared. After separating the ventricles from the atria, the hearts of the mice were cryopreserved, and the ventricular tissue was mechanically crushed for protein-chemical analysis. The centrifuged supernatant was used for Bradford protein determination to identify the protein concentration. Following this, a gel electrophoresis and Western blotting took place to detect and to determine the size of the proteins. To evaluate and to compare the results, protein levels were calibrated to the cardiomyocyte specific Calsequestrin. Results: Overexpression of PDE2 resulted in a fundamentally lower heart rate with preserved chronotropic adaptability and compensatory increased contractility. In addition, the TG mice showed a higher heart rate variability than the WT mice. There were no signs of influence on the HCN channel by the increased PDE2. With intensified stimulation of the β-adrenergic receptors, there was no significant difference in the increase in heart rate, but significantly fewer ventricular extrasystoles and arrhythmias in the TG mice than in the WT mice. Over time, the hypertrophic hearts, induced by Angiotensin II, showed an increased heart rate with preserved left ventricular function within both the WT and the TG mice. Nevertheless, both still showed an unspoiled sensitivity of the β-receptors, especially in regard of the ejection fraction. Both PKA- or CaMKII-dependent target proteins did not show an increased phosphorylation in neither of the phenotypes. Conclusion: As a summary, this thesis demonstrates that an overexpression of PDE2 as a cross link between the cGMP and cAMP signaling cascade reduces the heart rate similar to a beta blocker, without affecting the cardiac output. PDE2 prevented arrhythmias and still showed existing β-adrenergic receptor sensitivity in cardiac hypertrophy. This thesis could not show a protection against cardiac hypertrophy within the transgenic mice. Clinical data show upregulation of PDE2 in heart failure patients. Whether overstimulation of PDE2 in vivo and a consecutive increase in cAMP hydrolysis is actually cardioprotective in end-stage heart failure - or even before - requires further research.:Inhaltsverzeichnis I Abbildungsverzeichnis III Tabellenverzeichnis V Abkürzungsverzeichnis VI 1 Einleitung 1 1.1 Herzinsuffizienz 1 1.1.1 Epidemiologie 1 1.1.2 Ätiologie 2 1.1.3 Pathophysiologie 3 1.2 Behandlung der Herzinsuffizienz 4 1.2.1 Medikamentöse Behandlung 5 1.2.1.1 ACE-Hemmer und AT1-Antagonisten 5 1.2.1.2 Betablocker 5 1.2.1.3 Ivabradin 6 1.3 Wirkungen des vegetativen Nervensystems am Herzen 7 1.3.1 Physiologie der kardialen β-adrenergen Signalkaskade 7 1.3.2 Kompartimentierung in Kardiomyozyten 8 1.4 Physiologie der Phosphodiesterasen 9 1.4.1 Cyclisches Guanosinmonophosphat 9 1.4.2 Die Subtypen der Phosphodiesterasen 10 1.4.3 Die Interaktion von cGMP und cAMP 14 1.4.4 Die PDE2 in der Herzinsuffizienz 16 1.5 Vordaten 17 1.5.1 Überexpression von PDE2 im Mausmodell 17 1.6 Ziele dieser Arbeit 18 2 Material und Methoden 20 2.1 Herkunft und Gewinnung der Wildtyp- und transgenen Mäuse 20 2.1.1 Tierhaltung und Tötung 20 2.1.2 Genotypisierung der Mäuse 20 2.2 Echokardiographie zur Messung der kardiologischen Parameter 21 2.3 Einbau der telemetrischen Transmitter 24 2.4 Aufzeichnung des EKG 25 2.5 Einbau der osmotischen Minipumpen 25 2.6 Herzentnahme bei Mäusen 26 2.7 Proteinchemische Methode 26 2.7.1 Aufschluss des Herzgewebes zur proteinchemischen Analyse 26 2.7.2 Proteinbestimmung nach Bradford 27 2.7.3 SDS-PAGE 28 2.7.4 Transfer der Proteine auf Membranen (Westernblot) 29 2.7.5 Auftragen der Antikörper auf die Membranen 30 2.7.6 Aufnahmen 32 2.8 Statistische Auswertungen 32 3 Ergebnisse 33 3.1 Charakterisierung der Herzfunktion bei PDE2-Überexpression mittels EKG 33 3.1.1 Zirkadiane Messung der Herzfrequenz und Aktivität 33 3.1.2 Herzfrequenzvariabilität 35 3.1.3 Autonome Herzfunktion unter Ivabradin 36 3.1.4 Arrhythmieprovokation mit Isoproterenol 37 3.2 Die Rolle von PDE2 im Angiotensin II- induzierten kardialen Remodeling 41 3.2.1 Grundcharakterisierung der Herzfunktion bei niedriger PDE2- Überexpression mittels Echokardiographie 41 3.2.2 Auswirkung erhöhter PDE2-Spiegel nach chronischer Angiotensin II Applikation 43 3.3 Auswertung der Western Blots der PDE2A3-4808 Mäuse 49 4 Diskussion 54 4.1 Phosphodiesterase 2 reguliert die Herzfrequenz 54 4.2 Phosphodiesterase 2 schützt vor ventrikulären Arrhythmien 55 4.3 Phosphodiesterase 2 im kardialen Remodeling 56 4.4 Limitation der Überexpression durch zelluläre Kompartimentierung 58 4.5 Diskussion der Methodik und Bewertung der Ergebnisse 58 4.6 Ausblick: PDE2 als Downstream Target für Beta-Adrenorezeptor-Blockade? 59 5 Zusammenfassung/ Summary 61 5.1 Zusammenfassung 61 5.2 Summary 63 6 Anhang 66 6.1 Puffer 70 7 Literaturverzeichnis 7