Padronização da técnica de RT-q PCR Trioplex para detecção do gene L, M e S do vírus Oropouche

Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde e Ambiente. Instituto Evandro Chagas. Programa de Pós-Graduação em Virologia. Ananindeua, PA, Brasil.O vírus Oropouche (OROV), pertencente a família Peribunyaviridae, é um arbovírus causador de uma doença febril aguda em humanos, possuindo o genoma com três moléculas de ácido ribonucleico (S, M e L). É mantido em natureza nos ciclos urbano, onde o vírus é transmitido para o homem através da picada do inseto Culicoides paraenses e silvestre, através da transmissão de vetores Coquillettidia venezuelensis e Ochlerotatus serratus para animais vertebrados (primatas não humanos preguiças e aves). O diagnóstico laboratorial deste vírus tem sido realizado por técnicas sorológicas e isolamento viral, consideradas padrão ouro, sendo de baixo custo, porem demoradas. As técnicas moleculares possuem a vantagem de ser mais rápida específica e sensível, porém os protocolos disponíveis ate o momento tem como alvo o segmento S de OROV, o que pode levar a problemas com especificidade do diagnóstico, principalmente em decorrência dos rearranjos de segmentos gênicos entre os Orthobunyavirus, especialmente do segmento S. Portando este estudo teve como objetivo a padronização da técnica de RT-q PCR trioplex para detecção do gene S, L e M do vírus Oropouche. Um conjunto de iniciadores e sondas foi desenhado com base, para cada segmento (S, L e M), com a avaliação das regiões mais conservadas. Foi realizado o sequenciamento do isolado de OROV (Be H759021) para verificação de mutações. O isolado de BeH759021 foi submetido a duas quantificações, uma do segmento S em cópias /ml por PCR digital, e em PFU/ ml dos três segmentos S, L e M. A partir da quantificação foram feitas duas curvas padrão e análise do limite de detecção (LOD). Para a avaliação de sensibilidade clínica, foram testadas 24 amostras positivas e 24 negativas para OROV pelo diagnóstico primário, em paralelo com os iniciadores e sondas do protocolo de Naveca et al., 2017(NF), para comparação, e de onde se obteve os resultados de sensibilidade, especificidade e acurácia. A análise de especificidade analítica foi realizada pelo programa Primer-Blast e também foram testados RNAs de vírus da família Flaviviride e Togaviridae. Os resultados obtidos do LOD de OROV S do trioplex foi de 65,341 cópias/ml, enquanto que para o NF foi de 15,580 cópias/ml, já o LOD em PFU/ml foi de 25,903; 285,677 e 124,846 para OROV S, M e L, respectivamente. Das 48 amostras clínicas testadas, 21 deram positivas e 27 deram negativas para ambos os protocolos testados (Trioplex e NF), obtendo um resultado de sensibilidade, especificidade e acurácia de 100%, pois não houve divergência entre os resultados. De acordo com os achados, o ensaio de RT-qPCR desenvolvido foi sensível e específico, com a detecção e quantificação dos três segmentos de OROV, o que o torna um instrumento de auxilio em aplicações de diagnóstico, vigilância e investigação deste arbovírus que tem sido subnotificado