Validação de RT-PCR multiplex para detecção de rotavírus A, D, F e G em aves

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Instituto Evandro Chagas. Programa de Pós-Graduação em Virologia. Ananindeua, PA, Brasil.Os Rotavírus (RV) são considerados o principal patógeno que causa gastroenterite tanto em seres humanos, quanto em animais jovens de várias espécies, como as aves e os mamíferos. A transmissão dos RV ocorre principalmente por via fecal-oral, podendo ocorrer também por meio de água e alimentos contaminados. Os grupos de RV que infectam exclusivamente as aves são os RVA, RVD, RVF e RVG. No Brasil, os RV já foram detectados em aves de corte, aves domésticas e aves selvagens. No estado do Pará, já foram registrados os RVA, RVD, RVF e RVG em aves de corte e os RVD em aves silvestres, porém foram detectados em ensaios de RT-PCR separadamente, e por esse motivo é que se sugere um ensaio diagnóstico de PCR Multiplex para que esses agentes sejam detectados simultaneamente. Este estudo objetivou padronizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de Rotavírus A, D, F e G em aves. Foram utilizadas 21 amostras do banco de amostras do Instituto Evandro Chagas. Suspensões fecais a 10% em tampão Tris-Ca++ 0,01M foram realizadas, seguida da extração do genoma viral. A Reação em Cadeia mediada pela Polimerase precedida por Transcrição Reversa (RT-PCR Multiplex) foi realizada utilizando diferentes iniciadores específicos para RVA, RVD, RVF e RVG. Para confirmar a positividade das amostras, bem como a validação da RT-PCR Multiplex, os produtos da RT- PCR Multiplex foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2%, em seguida purificados e sequenciados pelo método de Sanger. Os primers foram avaliados quanto a sua especificidade e sensibilidade e a técnica de RT-PCR Multiplex foi avaliada quanto a sua reprodutibilidade, repetibilidade e o coeficiente de Kappa. Dessa forma, todos os primers foram específicos e com um limiar de detecção de 5x10- 5ng/µL. A técnica apresentou uma reprodutibilidade de 91,6%, repetibilidade 93,54% e o coeficiente de Kappa igual a 0,82. Dessa forma, o teste desenvolvido foi considerado uma ferramenta específica e sensível para a detecção simultânea dos diferentes grupos de RV que infectam aves