Evaluation of the role of C-terminal binding proteins (CtBP) in the neuroimmune response

Neuroinflammation is an inflammatory response that occurs at the level of the central nervous system (CNS). Various stimuli or injuries can trigger this response, such as ischemia, trauma, infections or exposure to toxins. Microglial cells, considered innate immune cells residing in the CNS, contribute to the neuroinflammatory response. These cells detect changes in brain homeostasis, migrate to the injured site and release inflammatory mediators capable of impacting neuronal survival. Lipopolysaccharide (LPS), one of the components of the outer membrane of gram-negative bacteria, is widely used as a model to understand the pathological mechanisms involved in neurodegeneration induced by neuroinflammation, as well as to identify potential therapeutic molecules. C-terminal binding proteins (CtBPs) are transcriptional coregulators that interact with transcription factors and repress transcription. These proteins are highly expressed in the CNS during embryonic development and regulate neuronal development, survival and function. However, knowledge about the regulation of the expression and function of CtBPs in conditions of neuroinflammation induced by LPS is still scarce. The first objective of this work was to evaluate the expression of CtBPs in in vivo and ex vivo experimental models of neuroinflammation induced by LPS and, subsequently, to evaluate their function in an ex vivo model. The expression of CtBPs was evaluated by Western-Blot analysis of hippocampi from adult C57BL/6J mice and in organotypic hippocampal slice cultures from 6- to 9-day-old C57BL/6J mice. It was concluded that the concentration of 500 µg/kg of LPS was the most effective in inducing an increase in the expression of CtBP1 and CtBP2 when the animals were exposed for 4 days. In mice exposed to the same concentration of LPS for 7 days, there was an increase in CtBP2 expression. On the other hand, exposure to 2 mg/kg of LPS for 24h induced as increase in CtBP1 expression. LPS, at different concentrations, also induced increased expression of CtBPs in organotypic hippocampal cultures. Next, we evaluated the glial response, in organotypic hippocampal slices obtained from C57BL/6J mice by Western-Blot analysis against glial fibrillary acidic protein (GFAP) and neutrophil cytosolic factor 1 (P47phox). To evaluate the involvement of CtBPs in the neuroinflammatory response, cultures were exposed to 4-methylthio-2-oxobutyric acid (MTOB), a modulator of CtBP activity that can act either as an inhibitor at high concentrations or an agonist at low concentrations. In some experiments, retinoic acid (RA) was also added as a potent anti-inflammatory agent. We observed that P47phox expression was reduced in slices exposed to LPS and/or MTOB and that RA was able to counteract this effect. The decreased expression of this phagocytic cell marker suggests implications for the inflammatory response of these cells. On the other hand, the increase in expression of this marker to levels similar to the control induced by RA may indicate an attempt to attenuate the inflammatory response. Regarding the analysis of GFAP expression, a decrease in its expression was observed in all experimental groups, suggesting that these compounds may be affecting the survival of astrocytes. In short, we can conclude that neuroinflammation induced by LPS triggers the expression of CtBPs in the hippocampus depending on the dose and time of exposure to the inflammatory agent and that RA can attenuate the effects induced by LPS+MTOB and can be considered a potential anti-inflammatory agent.A neuroinflamação é uma resposta inflamatória que ocorre ao nível do sistema nervoso central (SNC). Vários estímulos ou lesões podem desencadear esta resposta, como por exemplo isquémia, trauma, infeções ou exposição a toxinas. As células da microglia, consideradas células imunitárias inatas residentes no SNC, contribuem para a resposta neuroinflamatória. Estas células detetam alterações à homeostasia cerebral, migram para local lesado e libertam mediadores inflamatórios capazes de impactar na sobrevivência neuronal. O lipopolissacarídio (LPS), um dos componentes da membrana exterior de bactérias gram-negativas, é amplamente utilizado como modelo para compreender os mecanismos patológicos envolvidos na neurodegeneração induzida pela neuroinflamação, bem como para identificar potenciais moléculas terapêuticas. As proteínas de ligação C-terminal (CtBPs) são correguladores transcricionais que interagem com fatores de transcrição e reprimem a transcrição. Estas proteínas são altamente expressas no SNC durante o desenvolvimento embrionário e regulam o desenvolvimento, a sobrevivência e a função neuronal. Contudo, a compreensão da regulação da expressão e função das CtBPs em condições de neuroinflamação induzida pelo LPS, ainda é escassa. O primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão das CtBPs em modelos experimentais in vivo e ex vivo de neuroinflamação induzidos por LPS e, posteriormente, avaliar a sua função num modelo de fatias organotípicas de hipocampo ex vivo. A expressão das CtBPs foi avaliada por análise Western-Blot no hipocampo extraído de cérebros de murganhos adultos C57BL/6J e em fatias organotípicas de hipocampo de murganhos C57BL/6J com 6 a 9 dias de idade. Concluiu-se que a concentração de 500 µg/kg de LPS foi a mais eficaz a induzir o aumento de expressão de CtBP1 e CtBP2 quando os animais foram expostos durante 4 dias. Em murganhos expostos à mesma concentração de LPS, durante 7 dias, verificou-se o aumento de expressão de CtBP2. Por outro lado, a exposição com 2 mg/kg de LPS durante 24h induziu um aumento da expressão de CtBP1. O LPS, a diferentes concentrações, também induziu o aumento da expressão das CtBPs em culturas organotípicas de hipocampo. De seguida, avaliamos a resposta glial em fatias organotípicas de hipocampo, através da deteção da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e do fator citosólico 1 de neutrófilos (P47phox) por Western-Blot. Para avaliar o envolvimento das CtBPs na resposta neuroinflamatória, as culturas foram expostas ao ácido 4-metiltio-2-oxobutírico (MTOB), um modulador da atividade das CtBPs, podendo atuar como inibidor a altas concentrações e como agonista a baixas concentrações. Em algumas experiências foi também adicionado o ácido retinóico (RA), um potente agente anti-inflamatório. Observámos que a expressão de P47phox se encontrava diminuída em fatias expostas a LPS e/ou MTOB e que o AR foi capaz de contrariar este efeito. A diminuição da expressão deste marcador de células fagocíticas sugere implicações na resposta inflamatória dessas células. Por outro lado, o aumento da expressão deste marcador para níveis semelhante ao controlo induzido pelo AR, pode indicar uma tentativa de atenuar a resposta inflamatória. Relativamente à análise da expressão de GFAP, observou-se uma diminuição da sua expressão em todos os grupos experimentais em comparação com o grupo controlo, sugerindo que estes compostos podem estar a afetar a sobrevivência dos astrócitos. Em suma, podemos concluir que a neuroinflamação induzida por LPS desencadeia a expressão de CtBPs no hipocampo consoante a dose e o tempo de exposição ao agente inflamatório e que o AR consegue atenuar os efeitos induzidos pelos LPS+MTOB, podendo ser considerado um potencial agente anti-inflamatório