Die Aktivierung eines Gαq-gekoppelten Designerrezeptors reguliert die Aktivität des Tyrosinhydroxylase-Genpromotors in weiblichen katecholaminergen Neuroblastomzellen

Die Tyrosinhydroxylase ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Katecholaminbiosynthese, das die Umwandlung von L-Tyrosin in L-3,4- Dihydroxyphenylalanin katalysiert. Dadurch spielt das Enzym eine Schlüsselrolle in der Pathogenese verschiedenster Krankheiten, die katecholaminerge Systeme betreffen. Die Expression der Tyrosinhydroxylase kann über extrazelluläre Signalmoleküle wie epidermale Wachstumsfaktoren, Nervenwachstumsfaktoren und Steroide reguliert werden, die ihre Wirkung über Tyrosinkinase-Rezeptoren beziehungsweise Steroidhormonrezeptoren realisieren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Stimulation G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, der größten Rezeptorfamilie, zu einer gesteigerten Expression der Tyrosinhydroxylase führt. Als zelluläres Modell wurden katecholaminerge SH-SY5Y-Neuroblastomzellen verwendet, die Eigenschaften fetaler sympathischer Neuronen aufweisen und unter anderem die Tyrosinhydroxylase exprimieren. Die Aktivität des Tyrosinhydroxylase- Promotors wurde mit Reportergenen gemessen, die unter der Kontrolle des Tyrosinhydroxylase-Promotors standen und mit Hilfe von rekombinanten Lentiviren in das Chromatin der Neuroblastomzellen integriert wurden. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren können mit verschiedenen G-Proteinen interagieren. Um die Spezifität der Rezeptor-induzierten Signalkaskade sicherzustellen, wurde ein Gαq-gekoppelter Designerrezeptor (Rαq) in den Neuroblastomzellen exprimiert, der ausschließlich mit einem Gαq-Protein interagierte und der durch den synthetischen Liganden CNO aktiviert werden konnte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Stimulation des Gαq-gekoppelten Designerrezeptors die Transkription des Luziferase-Reportergens unter Kontrolle des proximalen Tyrosinhydroxylase-Promotors aktivierte. Die Transkription des Reportergens wurde durch die Überexpression von RGS2 (regulator of G-protein signaling-2), welches die GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit aktiviert, reduziert. Die Expression einer verkürzten, dominant-negativen Mutante der Phospholipase Cβ3 verminderte ebenfalls die Aktivität des Tyrosinhydroxylase-Promotors nach Stimulation des Designerrezeptors Rαq. Über die Interferenz von spezifischer shRNA (small hairpin RNA) gegen ERK1/2 konnte gezeigt werden, dass ERK1/2 als Signalübermittler zwischen dem 4 Designerrezeptor Rαq und dem Reportergen fungiert. Die Expression einer dominant- negativen Mutante des Transkriptionsfaktors CREB hemmte die Rαq-induzierte Aktivierung des Tyrosinhydroxylase-Promotors. Somit wurde CREB als nukleares Ziel der Rαq-initiierten Signalkaskade identifiziert. Expressionsversuche des adenoviralen Proteins E1A zeigten, dass die Transkription des Tyrosinhydroxylasegens unter epigenetischer Kontrolle steht und die Histonacetyltransferasen und Koaktivatorproteine CBP (CREB binding protein) und p300 involviert sind. Die Proteinphosphatasen MAP- Kinase-Phosphatase-1 und Calcineurin fungieren als Abschaltvorrichtungen für die Rαq- initiierte Signalkaskade, die die Gαq-gekoppelte Rezeptoraktivierung mit der Tyrosinhydroxylase-Gentranskription verbindet. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Expression der Tyrosinhydroxylase durch Gαq-gekoppelte Rezeptoren kontrolliert wird. Angesichts der Tatsache, dass die Stimulation Gαq-gekoppelter Designerrezeptoren Neurone aktiviert, postuliere ich, dass die Expression der Tyrosinhydroxylase durch neuronale Aktivität reguliert wird.Tyrosine hydroxylase is the rate-limiting enzyme of catecholamine biosynthesis, catalyzing the conversion of L-tyrosine to L-3,4-dihydroxyphenylalanine. Thus, the enzyme plays a key role in the pathogenesis of a wide variety of diseases affecting catecholaminergic systems. Tyrosine hydroxylase expression can be regulated by extracellular signaling molecules such as epidermal growth factors, nerve growth factors, and steroids, which act via receptor tyrosine kinases and steroid hormone receptors, respectively. This study investigated whether the stimulation of G protein-coupled receptors, the largest receptor family, leads to increased activation of the tyrosine hydroxylase promotor. Catecholaminergic SH-SY5Y neuroblastoma cells, which feature characteristics of fetal sympathetic neurons and express tyrosine hydroxylase, were used as a cellular model. Tyrosine hydroxylase promoter activity was measured using reporter genes under the control of the tyrosine hydroxylase promoter integrated into the chromatin of neuroblastoma cells using recombinant lentiviruses. G-protein-coupled receptors can interact with different G-proteins. To ensure the specificity of the receptor-induced signaling cascade, a Gαq-coupled designer receptor (Rαq) was expressed in the neuroblastoma cells that interacted exclusively with a Gαq- protein and that could be activated by the synthetic ligand CNO. The results of this study show that stimulation of the Gαq-coupled designer receptor activated transcription of the luciferase reporter gene under the control of the proximal tyrosine hydroxylase promoter. Transcription of the reporter gene was reduced by overexpression of RGS2 (regulator of G-protein signaling-2), which activates the GTPase activity of the Gα-subunit. Expression of a truncated dominant-negative mutant of phospholipase Cβ3 also decreased tyrosine hydroxylase promoter activity after stimulation of the designer receptor Rαq. Knockdown experiments involving ERK1/2- specific small hairpin RNAs showed that ERK1/2 act as a signal transducer between the designer receptor Rαq and the reporter gene. Expression of a dominant-negative mutant of the transcription factor CREB inhibited Rαq-induced activation of the tyrosine hydroxylase promoter. Thus, CREB was identified as a nuclear target of the Rαq-initiated signaling cascade. Expression experiments of the adenoviral protein E1A showed that 6 transcription of the tyrosine hydroxylase gene is under epigenetic control and involves the histone acetyltransferases and coactivator proteins CBP (CREB binding protein) and p300. The protein phosphatases MAP kinase phosphatase-1 and calcineurin act as turn- off devices for the Rαq-initiated signaling cascade linking Gαq-coupled receptor activation to tyrosine hydroxylase gene transcription. The results of this work suggest that tyrosine hydroxylase expression is controlled by Gαq-coupled receptors. Given the fact that stimulation of Gαq-coupled designer receptor activates neurons, I postulate that tyrosine hydroxylase expression is regulated by neuronal activity