Estudo dos mecanismos de citotoxicidade da cisplatina em células HEK 293 e avaliação do efeito protetor do composto probucol e seus derivados

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2023.A cisplatina é um agente antineoplásico utilizado no tratamento de diversos tipos de câncer. Apesar de seus efeitos positivos no tratamento do câncer, a nefrotoxicidade é um fator limitante na terapia com o fármaco. Uma das principais manifestações clínicas induzidas pela cisplatina é a lesão renal aguda (LRA). A LRA é uma condição caracterizada por um rápido declínio na função excretória dos rins, com consequente acúmulo de produtos nitrogenados no sangue. Diferentes mecanismos parecem contribuir para a patogenicidade renal do composto incluindo lesão vascular, inflamação, estresse oxidativo e morte celular. A ferroptose é um tipo de morte celular oxidativa dependente de ferro e vem sendo descrito em várias patologias que incluem doenças renais, cardiovasculares e neurodegenerativas. Em relação à cisplatina, o envolvimento da ferroptose no mecanismo de LRA induzido pelo fármaco ainda não está totalmente elucidado. O entendimento dos mecanismos de toxicidade da cisplatina é fundamental na busca por terapias de proteção. Atualmente não existe terapia efetiva capaz de prevenir ou mitigar o dano renal induzido pela cisplatina. Entretanto, diferentes estudos mostram que o uso de compostos antioxidantes pode representar uma importante opção na prevenção da lesão renal através da redução da produção de espécies reativas (ER). O probucol e seu derivado succinobucol são compostos fenólicos com atividade antioxidante principalmente relacionada a sua capacidade de modular defesas antioxidantes intracelulares e, recentemente, seus derivados RC363 e RC574 apresentaram efeitos protetores em diferentes modelos de ferroptose. Neste sentido, o objetivo geral do estudo é investigar o possível envolvimento da ferroptose no mecanismo de citotoxicidade da cisplatina, bem como, avaliar o efeito protetor do composto probucol e seus derivados em células de rim humano HEK 293. As células foram expostas a concentrações crescentes de cisplatina durante 3, 6, 12 e 24h e foram avaliados parâmetros de viabilidade celular, níveis de tióis não proteicos (NPSH), geração de ER e peroxidação lipídica. O tratamento com cisplatina causou redução na viabilidade celular em 24 horas, além de induzir redução nos níveis de NPSH e aumento na geração de ER após 6 horas de exposição. Para avaliação do efeito protetor do composto probucol e seus derivados, as células foram pré-tratadas durante 24 horas com os compostos e, em seguida, expostas à cisplatina. O tratamento com os compostos não foi capaz de proteger da diminuição da viabilidade celular induzida pela cisplatina. Para avaliar o envolvimento da ferroptose no mecanismo de toxicidade da cisplatina, as células foram pré-tratadas com compostos quelantes de ferro ou com o composto antiferroptótico clássico ferrostatina-1 (Fer-1), seguido pela exposição ao antineoplásico. Nenhum dos tratamentos realizados foi capaz de proteger a redução na viabilidade celular induzida pela cisplatina nas células HEK 293. Em conjunto, os resultados mostram que o estresse oxidativo está relacionado ao mecanismo de toxicidade da cisplatina em células HEK 293 e que o probucol e seus derivados, bem como os quelantes de ferro e a Fer-1 não foram efetivos na proteção da diminuição da viabilidade celular causada pela cisplatina. Por fim, foi identificado que a ferroptose não está envolvida no mecanismo de toxicidade da cisplatina em células HEK 293.Abstract: Cisplatin is an antineoplastic agent used in the treatment of several types of cancer. Despite its positive effects in cancer treatment, nephrotoxicity is a limiting is a limiting factor in therapy with the drug. One of the main clinical manifestations induced by cisplatin is acute kidney injury (AKI). AKI is a condition characterized by a rapid decline in the excretory function of the kidneys, with consequent accumulation of nitrogenous products in the blood. Different mechanisms appear to contribute to the renal pathogenicity of the compound including vascular injury, inflammation, oxidative stress, and cell death. Ferroptosis is a type of iron-dependent oxidative cell death. Its role has been described in various pathologies that include renal, cardiovascular, and neurodegenerative diseases. In relation to cisplatin, the involvement of ferroptosis in the mechanism of AKI induced by the drug is not yet fully elucidated. Understanding the mechanisms of cisplatin toxicity is fundamental in the search for protective therapies. Currently, there is no effective therapy capable of preventing or mitigating the renal damage induced by cisplatin. However, different studies show that the use of antioxidant compounds may represent an important option in the prevention of kidney injury by reducing the production of reactive species (RE). Probucol and its derivative succinobucol are phenolic compounds with antioxidant activity mainly related to their ability to modulate intracellular antioxidant defenses and, recently, their derivatives RC363 and RC574 showed protective effects in different models of ferroptosis. In this sense, the overall objective of the study is to investigate the possible involvement of ferroptosis in the mechanism of cytotoxicity of cisplatin, as well as, to evaluate the protective effect of the compound probucol and its derivatives in human kidney HEK 293 cells. Cells were exposed to increasing concentrations of cisplatin for 3, 6, 12 and 24h and parameters of cell viability, non-protein thiol levels (NPSH), ER generation and lipid peroxidation were evaluated. Cisplatin treatment caused a reduction in cell viability by 24 h, and induced a reduction in NPSH levels and an increase in ER generation after 6 h of exposure. To evaluate the protective effect of the compound probucol and its derivatives, cells were pretreated for 24 hours with the compounds and then exposed to cisplatin. Treatment with the compounds was not able to protect from the cisplatin-induced decrease in cell viability. To evaluate the involvement of ferroptosis in the mechanism of cisplatin toxicity, cells were pretreated with iron chelating compounds or the classical antiferroptotic compound ferrostatin-1 (Fer-1), followed by exposure to the antineoplastic. None of the treatments performed was able to protect the reduction in cell viability induced by cisplatin in HEK 293 cells. Taken together, the results show that oxidative stress is related to the mechanism of cisplatin toxicity in HEK 293 cells and that probucol and its derivatives as well as iron chelators and Fer-1 were not effective in protecting the reduction in cell viability caused by cisplatin. Finally, it was identified that ferroptosis seems not to be involved in the mechanism of cisplatin toxicity in HEK 293 cells