Estudo do efeito anti-inflamatório de derivados da 1,4-dihidropiridina e a importância das determinações de mediadores pró-inflamatórios na fase de triagem de compostos com possível atividade anti-inflamatória in vitro : uma Revisão Sistemática e Meta-análise

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2023.Introdução: O processo inflamatório representa a base fisiopatológica de inúmeras patologias. Trata-se de um mecanismo de defesa do organismo contra agentes infecciosos ou injúria tecidual. Entender os mecanismos subjacentes à inflamação e desenvolver novos agentes terapêuticos que reduzam os danos inflamatórios ainda continuam sendo os pilares de estudos farmacológicos. Derivados dihidropiridinicos apresentam inúmeras atividades biológicas já descritas, podendo ser bons candidatos a novas terapias anti-inflamatórias. Objetivos: Este estudo teve como objetivo investigar a racionalidade da dosagem de diferentes mediadores inflamatórios no modelo de inflamação in vitro utilizando células RAW 264.7, através de uma revisão sistemática (RS) e meta-análise, bem como investigar o efeito anti-inflamatórios de derivados da 1,4-Dihidropiridina (1,4-DHP) em modelos in vitro, utilizando células RAW264.7 induzidas por LPS e in vivo, através do modelo de lesão pulmonar aguda (LPA) em camundongos. Metodologia: Realizamos uma RS com meta-análise com base na declaração PRISMA, selecionando a partir de busca em bases de dados, trabalhos científicos específicos que tivessem realizado a dosagem de mediadores inflamatórios utilizando o modelo de células RAW 264.7 induzidas com LPS. Posteriormente os dados foram extraídos e a meta-análise realizada, com o intuito de verificar qual a eficácia da dosagem do TNF-a, IL-6 e IL-1ß como biomarcadores inflamatórios, comparados ao Óxido Nítrico (NO). Na segunda fase do trabalho, quinze compostos derivados da 1,4-DHP foram testados em células RAW 264.7 para avaliar seus efeitos citotóxicos. Posteriormente, foram avaliados quanto seus efeitos sobre fagocitose de macrófagos e na produção de mediadores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios. Por último, verificamos esses efeitos in vivo, utilizando o de LPA em camundongos, dosando mediadores inflamatórios (citocinas, NO e Mieloperoxidase (MPO)) e a migração leucocitária e exsudação. Resultados: Na primeira etapa da revisão, um total de 17 estudos foram incluídos. Células induzidas por LPS produziram altos níveis de NO em comparação com células não induzidas e essa produção não apresentou relação com a densidade celular utilizada. TNF-a, IL-1ß e IL-6 também apresentaram níveis elevados após as células terem sido estimuladas com LPS; no entanto, parte desses efeitos parecem ter relação com a densidade celular. Todos os estudos foram confiáveis com restrições, tendo em vista que foram identificados problemas quanto a qualidade metodológica e qualidade de relatórios. Em seguida, na realização de experimentos, verificou-se que um dos compostos derivados da 1,4-DHP, foi efetivo em inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias e do mediador NO em células RAW264.7 induzidas por LPS, além disso, o composto em questão aumentou a fagocitose das células e da produção da citocina IL-10 no sobrenadante das culturas celulares, indicando uma possível polarização de macrófagos para o fenótipo M2. Por fim, no modelo de LPA, o composto selecionado inibiu a migração leucocitária e a exsudação no LBA, além de reduzir a atividade da enzima MPO e a produção de NO e citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-a. Conclusão: Dosar os níveis de NO é uma opção suficiente e racional para iniciar os ensaios de triagem anti-inflamatória de compostos utilizando células RAW 264.7 como plataforma experimental. Além disso, o composto selecionado derivado da 1,4-DHP apresentou importante atividade anti-inflamatória, reduzindo a produção de mediadores pró-inflamatórios e aumentando a atividade fagocítica de macrófagos e secreção de IL-10. Esses achados indicam a que a atividade anti-inflamatória do composto deve-se a capacidade de reverter a polarização dos macrófagos para um perfil anti-inflamatório (M2).Abstract: Introduction: Although essential in the innate immune response, the inflammatory process represents the pathophysiological basis of numerous pathologies. It is a defense mechanism of the body against infectious agents or tissue injury. Understanding the mechanisms underlying inflammation and developing new therapeutic agents that reduce inflammatory damage still remain the mainstays of pharmacological studies. Dihydropyridine derivatives have numerous biological activities already described, and may be good candidates for new anti-inflammatory therapies. Objectives: This study aimed to investigate the rationality of the dosage of different inflammatory mediators in the in vitro inflammation model using RAW 264.7 cells, through a systematic review (RS) and meta-analysis, as well as to investigate the anti-inflammatory effect of 1 ,4-Dihydropyridine (1,4-DHP) in in vitro models, using RAW264.7 cells induced by LPS and in vivo, through the model of acute lung injury in mice. Methodology: In the first stage of this work, we carried out an SR with meta-analysis based on the PRISMA statement, selecting from a search in databases, specific scientific works that had performed the measurement of inflammatory mediators (NO, TNF-, IL-6 and IL -1ß) using the LPS-induced RAW 264.7 cell model. Subsequently, the data were extracted and the meta-analysis performed, with the aim of verifying the effectiveness of the dosage of TNF-a, IL-6 and IL-1ß as inflammatory biomarkers, compared to Nitric Oxide (NO). In the second phase of the work, fifteen compounds derived from 1,4-DHP were tested in RAW 264.7 cells to evaluate their cytotoxic effects. Subsequently, their effects on macrophage phagocytosis and on the production of pro-inflammatory (NO, TNF-a, INF-?, IL-12, MCP-1, IL-6) and anti-inflammatory (IL-10). Finally, we verified whether these effects would be repeated in vivo, using the acute lung injury (ALI) model in mice, measuring inflammatory mediators (cytokines, NO and Myeloperoxidase (MPO)) and leukocyte migration and exudation. Results: In the first step of the review, a total of 17 studies were included. As expected, cells induced by LPS produced higher levels of NO compared to non-induced cells and this production was not related to the cell density used. TNF-a, IL-1ß and IL-6 also showed elevated levels after cells were stimulated with LPS; however, part of these effects seem to be related to cell density. All studies were reliable, although with some restrictions, considering that problems were identified regarding methodological quality and quality of reports for specific items, mainly related to compounds and test systems. Then, in carrying out experiments, it was found that one of the compounds derived from 1,4-DHP was effective in inhibiting the production of cytokines IL-12, MCP-1, IFN-? and IL-6 and the mediator NO in RAW264.7 cells induced by LPS, moreover, the compound in question increased the phagocytosis of the cells and caused an increase in the production of the cytokine IL-10 in the supernatant of cell cultures, indicating a possible polarization of macrophages from the M1 phenotype to M2. Finally, in the ALI model, the selected compound was effective in inhibiting leukocyte migration and exudation in BALF, reducing the activity of the MPO enzyme and the production of NO and pro-inflammatory cytokines IL-6 and TNF-a. Conclusion: Measuring NO levels is a sufficient and rational option to start anti-inflammatory compound screening assays using RAW 264.7 cells as an experimental platform. Furthermore, the selected compound derived from 1,4-DHP showed important anti-inflammatory activity, reducing the production of pro-inflammatory mediators and increasing the phagocytic activity of macrophages and IL-10 secretion. These findings indicate that the anti-inflammatory activity of the compound is due to the ability to reverse the polarization of macrophages to an anti-inflammatory profile (M2)