Investigação dos mecanismos de morte celular envolvidos na citotoxicidade dos compostos 4-nitrochalcona e dietilditiocarbamato de sódio trihidratado sobre linhagens celulares humanas de neoplasias hematológicas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2023.O câncer é uma das principais causas de morte no mundo e uma barreira para o aumento da expectativa de vida em todos os países. As neoplasias hematológicas, dentre as quais se destacam as leucemias, os linfomas e o mieloma múltiplo, apresentam alta prevalência na população brasileira e são consideradas um importante problema de saúde pública devido a agressividade, bem como as altas taxas de recidiva e de mortalidade relacionadas a alguns subtipos dessas doenças. A quimioterapia é a estratégia de tratamento mais utilizada no combate às neoplasias hematológicas, entretanto, essa abordagem terapêutica apresenta limitações importantes na sua efetividade em função de características farmacocinéticas relacionadas ao alcance dos fármacos às células alvo, em concentrações adequadas; citotoxicidade não seletiva dos agentes terapêuticos, o que resulta em efeitos adversos que comprometem a qualidade de vida e a segurança dos pacientes; além do desenvolvimento de resistência ao tratamento com fármacos citotóxicos atualmente disponíveis no arsenal terapêutico. Assim, a descoberta de novas moléculas com atividade antitumoral que sejam efetivas e seletivas para as células neoplásicas, bem como a investigação dos seus principais mecanismos de citotoxicidade, é um grande desafio para pesquisadores da área de oncologia experimental. Nessa perspectiva, a 4-nitrochalcona (4NC) e o dietilditiocarbamato de sódio tri-hidratado (DETC) são compostos pertencentes à classe das chalconas e dos ditiocarbamatos, respectivamente, que se apresentam como potenciais protótipos para o desenvolvimento de novos fármacos, pois são reconhecidos na literatura pela sua atividade antineoplásica. Contudo, esses compostos não foram avaliados sobre células de neoplasias hematológicas e, além disso, seus efeitos sobre células não neoplásicas presentes no microambiente da medula óssea ainda não foram investigados. Considerando o exposto, no presente estudo foi investigada a atividade citotóxica da 4NC e do DETC sobre linhagens celulares de leucemia mieloide aguda (LMA) (K562), linfoma de Burkitt (Daudi), mieloma múltiplo (MM.1S) e estroma de medula óssea (HS-5). Os estudos in silico sugerem que ambos os compostos apresentam propriedades físico-químicas adequadas para uma boa biodisponibilidade oral, e apontam propriedades farmacocinéticas que podem ser melhoradas no desenvolvimento de novos fármacos a partir da 4NC e do DETC. Os ensaios de viabilidade celular, realizados pelo método do MTT, indicam que os compostos são citotóxicos para as células K562, Daudi e MM.1S, bem como são seletivos na indução dessas células neoplásicas à morte, e apresentam potencial hemolítico apenas em altas concentrações. Os mecanismos de citotoxicidade da 4NC e do DETC foram investigados sobre as células K562 e Daudi, as quais se mostraram mais sensíveis aos compostos. Os resultados sugerem que os compostos 4NC e o DETC bloqueiam o ciclo das células Daudi e K562 na fase G2/M (com exceção da 4NC sobre células Daudi) e que resultam na produção de espécies reativas de oxigênio EROs em ambas as linhagens celulares. Com relação ao mecanismo de morte celular, a avaliação da morfologia das células K562 e Daudi, bem como a investigação da exposição dos resíduos de fosfatidilserina e da expressão de fatores pró e antiapoptóticos (Bax, Bcl-2, potencial de membrana mitocondrial [??m], AIF, survivina, caspase-3 ativada e FasR) fornecem evidências da indução de morte celular por apoptose intrínseca e extrínseca após o tratamento das células K562 com a 4NC e com o DETC, e das células Daudi com a 4NC. Já o efeito do DETC sobre as células Daudi parece não envolver a indução da apoptose. Em conclusão, os compostos 4NC e DETC são protótipos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de LMA e linfoma de Burkitt, os quais apresentam seletividade para as células neoplásicas avaliadas no presente estudo; bem como induzem a produção de EROs e levam as células K562 e Daudi à morte celular por apoptose, com exceção do DETC sobre células Daudi.Abstract: Cancer is one of the leading causes of death in the world and a barrier to increasing life expectancy in all countries. Hematological neoplasms, including leukemias, lymphomas and multiple myeloma, have a high prevalence in the Brazilian population and are considered an important public health problem due to their aggressiveness, as well as the high rates of recurrence and mortality related to some subtypes of these diseases. Chemotherapy is the most used treatment strategy against hematological malignancies, however this therapeutic approach has important limitations in its effectiveness due to pharmacokinetic characteristics related to the reach of drugs to target cells in adequate concentrations; non-selective cytotoxicity of therapeutic agents, which results in adverse effects that compromise patients' quality of life and safety; and the development of resistance to treatment with cytotoxic drugs currently available in the therapeutic arsenal. Thus, discovery of new molecules with antitumor activity that are effective and selective for neoplastic cells, as well as investigation of their main cytotoxicity mechanisms, is a great challenge for researchers in the field of experimental oncology. In this perspective, 4-nitrochalcone (4NC) and sodium diethyldithiocarbamate trihydrate (DETC) are compounds belonging to the class of chalcones and dithiocarbamates, respectively, that present themselves as potential prototypes for the development of new drugs, since they are described in literature due to their antineoplastic activity. However, these compounds have not been evaluated on hematological neoplasm cells and their effects on non-neoplastic cells present in the bone marrow microenvironment have not been investigated yet. Considering all the above, present study investigated the cytotoxic activity of 4NC and DETC on cell lines of acute myeloid leukemia (AML) (K562), Burkitt's lymphoma (Daudi), multiple myeloma (MM.1S) and bone marrow stroma (HS -5). In silico studies suggest that both compounds have adequate physicochemical properties for good oral bioavailability, and point to pharmacokinetic properties that can be improved in the development of new drugs from 4NC and DETC. Cell viability assays, performed by the MTT method, indicate that compounds are cytotoxic to K562, Daudi and MM.1S cells, as well as being selective in inducing these neoplastic cells to death, and have hemolytic potential only at high concentrations. Cytotoxic mechanisms of 4NC and DETC were investigated on K562 and Daudi cells, which were shown to be more sensitive to the compounds. The results suggest that 4NC and DETC block the cell cycle of Daudi and K562 cells in G2/M phase (except for 4NC on Daudi cells) and result in the production of reactive oxygen species (ROS) in both cell lines. Regarding the mechanism of cell death, evaluation of K562 and Daudi morphology, as well as investigation of phosphatidylserine residue exposure and expression of pro- and anti-apoptotic factors (Bax, Bcl-2, mitochondrial membrane potential [??m], AIF, survivin, activated caspase-3, and FasR) provide evidence of intrinsic and extrinsic apoptosis after treatment of K562 cells with 4NC and DETC, and Daudi cells with 4NC. The effect of DETC on Daudi cells does not seem involve apoptosis cell death. In conclusion, the 4NC and DETC compounds are promising prototypes for new drugs development for acute myeloid leukemia and Burkitt's lymphoma, which are selective for the neoplastic cells evaluated in the present study; as well as induce the production of ROS and lead K562 and Daudi cells to apoptosis, with the exception of DETC on Daudi cells