Variações do número de cópias e longos trechos contíguos de homozigose detectados por microarray cromossômico (CMA) em pacientes com distúrbios do neurodesenvolvimento e/ou anomalias congênitas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2023.Nas últimas décadas, a citogenética molecular experimentou avanços significativos na investigação genética dos Distúrbios do Neurodesenvolvimento (DsND), como a Deficiência Intelectual (DI) e/ou o Transtorno do Espectro do Autismo (TEA), que afetam em torno de 3-4% da população mundial e podem estar associados à presença de anomalias congênitas (ACs) e/ou características dismórficas (DF) (dismorfismos - sindrômicos). Em especial, os exames genéticos baseados em microarranjos cromossômicos, conhecidos como CMA (Chromosomal Microarrays), tornaram-se uma ferramenta essencial na avaliação das Variações no Número de Cópias (CNVs), que incluem microdeleções e microduplicações, em pacientes afetados por DsND. As CNVs envolvem ganhos e perdas de material genômico e podem abranger regiões que contêm genes expressos no cérebro ou que desempenham um papel crucial no neurodesenvolvimento. Essas alterações na dosagem genética podem ter um papel significativo na patogênese de distúrbios do desenvolvimento. As plataformas modernas de CMA com alta densidade combinam sondas de oligonucleotídeos para a detecção de CNVs com sondas para Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs). Isso permite a identificação de regiões de Homozigose Cromossômica Completa ou Segmentar, conhecidas como Longos Trechos Contíguos de Homozigose (LCSH, Long Contiguous Stretches of Homozygosity). A presença destes LCSH pode ser indicativa de Dissomia Uniparental (UPD), consanguinidade, endogamia, características populacionais específicas, bem como eventos de reparo replicativo de DNA. Este estudo teve como principais objetivos: (1) Revisar a literatura quanto à origem dos DsND, ao papel das CNVs como fator etiológico para os DsND, às aplicações clínicas de várias plataformas de CMAs sua aplicação mundial e às taxas de diagnóstico através do CMA; (2) Analisar, interpretar e caracterizar CNVs, identificar a taxa diagnóstica do CMA em um coorte de indivíduos afetados DsND e/ou ACs do sul do Brasil, com foco nos casos com TEA, bem como avaliar as frequências fenotípicas e as implicações dos LCSHs detectados por exames de CMA. Para o objetivo (1), no repositório PUBMED/MEDLINE, foi analisada a literatura publicada entre 2010 e 2023 por palavras chave no título ou resumo. Dentre os 189 estudos de coorte encontrados, 84 publicações que preencheram os critérios estabelecidos foram selecionadas, mostrando uma taxa diagnóstica média de 16,8% para detecção de CNVs patogênicas por CMA. Esses estudos contemplam diferentes populações e etnias, com as maiores amostras em países do hemisfério norte. Apesar do sequenciamento de Exoma e os exames por CMA serem recomendados como testes de primeira linha na investigação dos DsND, na realidade econômica de países menos desenvolvidos o uso da citogenética clássica ainda é predominante, quando não é o único recurso. Para o objetivo (2), foi realizada uma análise retrospectiva de arquivos de leitura de CMAs das plataformas da Affymetrix CytoScan®HD [41%] ou CytoScan® 750K [59%], assim como foram coletados e analisados os dados clínicos disponíveis de 1.012 indivíduos afetados. Estes eram sua maioria crianças com DsND e/ou ACs, cujos exames foram solicitados por geneticistas e neurologistas para fins de diagnóstico. A análise revelou 206 CNVs consideradas patogênicas (PCNV), incluindo 132 deleções e 74 duplicações, fornecendo uma resposta diagnóstica para 17% dos indivíduos da coorte. Além disso, 12% dos pacientes apresentaram variantes raras de significado clínico incerto (VUS), em alguns casos consideradas possivelmente patogênicas (LPCNV), porém sem uma conclusão diagnóstica, como principal CNV clinicamente relevante. Para 71% da coorte nenhuma CNV clinicamente relevante foi encontrada. Considerados com crescente relevância dentre os DsND, os indivíduos com TEA representaram cerca de um terço dos casos analisados (333). Analisados como sub-coorte, a taxa de diagnóstico para TEA foi de 10%, com variações dependendo da presença de características dismórficas (16%) ou da ocorrência \"isolada\" do TEA (7%). Utilizando a capacidade destas plataformas de reconhecer regiões homozigotas, LCSH (=3 Mbp) foram analisados tanto no contexto de seu possível significado patogênico, quanto para identificar LCSH potencialmente derivados de haplótipos ancestrais da população. Esta análise foi possível para 953 CMAs, revelando que LCSH estavam presentes em 91% dos exames. Em 11,5% dos indivíduos, sugeriram consanguinidade do primeiro ao quinto grau entre seus progenitores, com possível impacto clínico, e em 2,8%, revelaram uma potencial UPD. Aqueles LCSH encontrados com frequência de 5% ou mais na coorte foram considerados LCSH comuns na população em geral, permitindo delinear 10 regiões como sendo potenciais haplótipos ancestrais de relevância clínica baixa. Em relação aos fenótipos clínicos desta coorte, as principais indicações para o CMA foram atraso no desenvolvimento (56%), DI (33%), TEA (33%), e características dismórficas (56%). Certos fenótipos clínicos foram associados a uma maior probabilidade de indicar um portador de uma CNV patogênica. As CNVs raras encontradas, assim como as LCSH que possivelmente representem UPDs foram caracterizadas e registradas junto com os principais fenótipos apresentados por cada paciente. As LCSH consideradas potenciais haplótipos ancestrais segregando na população do sul do Brasil, foram registradas para auxiliar na interpretação e priorização de LCHS que efetivamente tem uma maior relevância clínica. Este estudo representa o maior conjunto de dados de CMA em uma coorte de pacientes com DsND e/ou ACs na região sul do Brasil até o momento. Este trabalho destaca a importância da interpretação de CNVs e LCSH na prática clínica, inclusive no contexto do TEA.Abstract: In recent decades, molecular cytogenetics has seen significant advances in genetic research on Neurodevelopmental Disorders (NDDs), such as Intellectual Disability (ID) and/or Autism Spectrum Disorder (ASD), which affect around 3-4% of the global population and can be associated with the presence of congenital anomalies (CAs) and/or dysmorphic features (DF) (dysmorphisms - syndromic). In particular, genetic tests based on chromosomal microarrays, known as CMA (Chromosomal Microarrays), have become an essential tool in the assessment of Copy Number Variations (CNVs), including microdeletions and microduplications, in patients affected by NDDs. CNVs involve gains and losses of genomic material and can encompass regions containing genes expressed in the brain or playing a crucial role in neurodevelopment. These changes in genetic dosage can play a significant role in the pathogenesis of developmental disorders. Modern CMA platforms with high density combine oligonucleotide probes for CNV detection with probes for Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). This allows the identification of regions of Complete or Segmental Chromosomal Homozygosity, known as Long Contiguous Stretches of Homozygosity (LCSH). The presence of these LCSH may be indicative of Uniparental Disomy (UPD), consanguinity, endogamy, specific population characteristics, as well as replicative DNA repair events. For goal (1), in the PUBMED/MEDLINE repository, the literature published between 2010 and 2023 was analyzed by keywords in the title or abstract. Among the 189 cohort studies found, 84 publications that met the established criteria were selected, demonstrating an average diagnostic rate of 16.8% for the detection of pathogenic CNVs by CMA. These studies encompass different populations and ethnicities, with the largest samples from northern hemisphere countries. Despite Exome sequencing and CMA tests being recommended as first-line tests in the investigation of NDDs, in the economic reality of less developed countries, classical cytogenetics is still predominant, if not the only resource. For objective (2), a retrospective analysis of CMA reading files from the Affymetrix CytoScan®HD [41%] or CytoScan® 750K [59%] platforms was performed, and clinical data were collected and analyzed for 1,012 affected individuals. The majority of these individuals were children with NDDs and/or CAs, whose tests were requested by geneticists and neurologists for diagnostic purposes. The analysis revealed 206 CNVs considered pathogenic, including 132 deletions and 74 duplications, providing a diagnostic answer for 17% of the individuals in the cohort. Furthermore, for 12% of patients the only clinically relevant CNV were Variants of Uncertain Significance (VUS), in some cases interpreted as likely pathogenic (LPCNV), however not considered a clear diagnostic conclusion. For 71% of the cohort, no clinically relevant CNVs were found. With a growing significance among NDDs, individuals with ASD represented about one-third of the cases analyzed (333). When analyzed as a sub-cohort, the diagnostic rate for ASD was 10%, with variations depending on the presence of dysmorphic features (16%) or when considered as having \"isolated\" ASD (7%). Using the capability of these platforms to recognize homozygous regions, LCSH (=3 Mbp) were analyzed both in the context of their potential pathogenic significance and to identify LCSH that could potentially be derived from ancestral population haplotypes. This analysis was feasible for 953 CMAs, revealing that LCSH were present in 91% of the tests. In 11.5% of individuals, they suggested consanguinity from the first to the fifth degree among the parents, with potential clinical implications, and in 2.8% they revealed a potential Uniparental Disomy (UPD). Those LCSH found with a frequency of 5% or more in the cohort were considered common LCSH in the general population, allowing the delineation of 10 regions as ancestral haplotypes of potentially low clinical relevance. Regarding the clinical phenotypes of this cohort, the primary indications for CMA were developmental delay (56%), ID (33%), ASD (33%), and dysmorphic features (56%). Certain clinical phenotypes were associated with a higher likelihood of indicating a carrier of a pathogenic CNV. The rare CNVs found, as well as the LCSH that may represent UPDs, were characterized and recorded along with the main phenotypes presented by each patient. LCSH considered potential ancestral haplotypes segregating in the population of southern Brazil were recorded to assist in the interpretation and prioritization of LCSH that indeed have greater clinical relevance. This study represents the largest dataset of CMA in a cohort of patients with NDDs and/or CAs in the southern region of Brazil to date. This work highlights the importance of interpreting CNVs and LCSH in clinical practice, including in the context of ASD