Der nicht-selektive Kationenkanal TRPC6 in menschlichen Gefäßen

Zusammenfassung 1.1 Zusammenfassung (english version below) 1.1.1 Einleitung und klinische Relevanz Kardiovaskuläre Erkrankungen sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Der nicht-selektive Ionenkanal TRPC6 spielt in der Physiologie und Pathophysiologie der Gefäße eine wichtige Rolle. Der TRPC6-Kanal ist ein membranständiger, nichtselektiver, kalziumpermeabler Kationenkanal. Als solcher ist er in der Regulation des Kalziumhaushalts von TRPC6-Kanal exprimierenden Zellen maßgeblich beteiligt. Aktuelle Erkenntnisse über die Funktion des TRPC6-Kanals in Gefäßen beruhen hauptsächlich auf dem Tiermodell oder Zellkulturen. Dass er in menschlichen Geweben jedoch relevante Aufgaben hat, zeigt sich in einigen Krankheitsbildern, wie der fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) oder der Idiopathisch pulmonalarteriellen Hypertonie (IPAH), an deren Ätiologie der TRPC6-Kanal beteiligt ist. Allerdings sind Arbeiten zum Nachweis des Kanals in menschlichen Gefäßen bislang sehr rar. Eine bessere Erforschung der Expression und Lokalisation des TRPC6-Kanals ermöglicht in Zukunft ein besseres Verständnis seiner Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Ziel dieser Forschungsarbeit ist der erste systematische Nachweis von TRPC6-Kanälen in menschlichen Gefäßen. Dafür erfolgte ein spezifischer Proteinnachweis des TRPC6-Kanals mittels immunhistochemischer Färbung (IHC). Die histologische Auswertung soll als Grundlage für die weitere Erforschung des TRPC6-Kanals dienen. 1.1.2 Methodik Standardisiert wurden verschiedene Gefäßabschnitte aus insgesamt neun Körperspendern des Anatomischen Institutes der Universität des Saarlandes entnommen und in Formaldehyd immersionsfixiert. Anschließend wurden die Präparate in Paraffin eingebettet und mittels eines Mikrotoms in sieben Mikrometer dünne Proben geschnitten. Die Präparate wurden zunächst mittels Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt und auf intakte Morphologie der Gefäße beurteilt, als Grundvoraussetzung für die IHC. In dieser wurden die Proben mit einem Knockout-validierten Primärantikörper gegen TRPC6-Antigenstrukturen in einer Konzentration von 1:100 inkubiert. Die Spezifität und Qualität des Antikörpers wurde mittels peptidblockierten Kontrollproben nochmals überprüft. Als sekundärer Antikörper wurden Horseredish-Peroxidase (HRP) konjugierte Goat anti-rabbit-Antikörper (GOT) in einer Konzentration von 1:500 verwendet. Die Verdünnungen erfolgten mit Normal-Goat-Serum (NGS). Das hinzugefügte Chromogen 3,3´-Diaminobenzidin (DAB) wurde durch eine von der HRP katalysierten Chromogenumsetzung durch eine Braunfärbung objektivierbar. Die Auswertung der Proben erfolgte lichtmikroskopisch. Als zusätzlicher Nachweis des TRPC6-Proteins wurde ein Western Blot an skelettierten Gefäßproben durchgeführt. Um einen möglichen Zusammenhang zwischen COVID-19 assoziierten Gefäßpathologien und dem TRCP6-Kanal zu untersuchen, wurden Proben von fünf Patienten, die an COVID-19 verstorben waren, in diese Arbeit miteinbezogen. 1.1.3 Ergebnisse und Interpretation Die systematische Auswertung von spezifischen Proteinnachweisen des TRPC6-Kanals mittels IHC zeigt Unterschiede bezüglich seines Proteinvorkommens in den Gefäßwandschichten sowie in verschiedenen Gefäßabschnitten. In vielen Fällen (50 %) konnten in der Tunica intima sowohl im Endothel als auch im Stratum subendotheliale der TRPC6-Kanal nachgewiesen werden. Gehäuft konnte der TRPC6-Kanal beispielsweise in Nierenarterien und Aorten nachgewiesen werden. Ein Nachweis des TRPC6-Kanals in der Tunica media konnte in kaum einer der untersuchten Proben gelingen (2,5 %). Dies suggeriert, dass der TRPC6-Kanal auf Zellen dieser Schicht nicht exprimiert wird. Eine Ausnahme hiervon weisen die COVID-19 Proben auf, welche als einzige braune Herde in der Tunica media zeigen. Dies könnte einen Hinweis auf ein Mitwirken des TRCP6-Kanals bei COVID-19assoziierten Gefäßpathologien darstellen. Die Adventitia zeigte im Vergleich zwischen verschiedenen Gefäßabschnitten zwar einen häufigen TRPC6-Kanal Nachweis (55 %), jedoch kein klares Färbungsmuster. Lediglich einzelne Strukturen in der Adventitia, wie Vasa vasorum, stellten sich reproduzierbar positiv bzgl. des immunhistochemischen Proteinnachweises von TRPC6-Kanälen dar. Diese Ergebnisse legen eine Beeinflussung der Gefäßweitstellung des TRPC6-Kanals in den untersuchten Gefäßabschnitten nahe. Im Einklang mit aktuellen Studien könnte der TRPC6-Kanal somit bspw. an Prozessen der Stickstoffmonoxid (NO) vermittelten Vasodilatation, aber auch an Proliferation und Fibrose in Gefäßwänden, wie bspw. bei der Idiopathischen pulmonalarteriellen Hypertonie (IPAH), beteiligt sein. Entgegen der aktuellen Mehrheit von Forschungsmeinungen konnte kein Proteinnachweis des TRPC6-Kanals mittels IHC in der Tunica media in menschlichen Gefäßen erfolgen. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass der TRCP6 Kanals keinerlei Einflüsse auf vasoaktive Effekte hat, welche durch die glatten Gefäßmuskelzellen in der Tunica Media vermittelt werden. Studien zu diesem Thema beziehen sich allerdings fast ausschließlich auf Tiermodelle oder Zellkulturen, was den Wert eines Proteinnachweises in humanen Gefäßen unterstreicht. 1.1.4 Ausblick in die Zukunft Das Verständnis der Pathogenese kardiovaskulärer Erkrankungen ist aufgrund der hohen Prävalenz und Mortalität dieser Entitäten von immenser Bedeutung. Durch heute bereits bekannte Möglichkeiten der pharmakologischen Modulation des TRPC6-Kanals könnten sich für die Zukunft bedeutsame neue Therapieoptionen für Patientengruppen mit kardiovaskulären Erkrankungen erschließen. Jedoch ist eine weitere Erforschung des TRPC6-Kanals, zur Identifizierung seiner Aufgaben und seiner Rolle in pathophysiologischen Prozessen, in menschlichen Gefäßen unerlässlich. 1.2 Abstract 1.2.1 Introduction and clinical relevancy Cardiovascular disease is one of the leading causes of death worldwide. The transient receptor potential canonical 6 (TRPC6) channel plays an important role in the physiology and pathophysiology of blood vessels. The TRPC6-channel is a membrane-bound, nonselective, calcium-permeable cation channel. As such, it is significantly involved in the regulation of the calcium balance of cells expressing the TRPC6-channel. Current knowledge about the function of the TRPC6-channel in vessels is mainly based on the animal model or cell cultures. The fact that it has relevant tasks in human tissues can be seen in some clinical pictures, such as focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) or idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH), in the etiology of which the TRPC6-channel is involved. However, work on the detection of the canal in human vessels has been very rare so far. Better research into the expression and localization of the TRPC6-channel will enable a better understanding of its role in physiological and pathophysiological processes in the future. The aim of this research work is the first systematic detection of TRPC6-channels in human vessels. For this purpose, a specific protein detection of the TRPC6-channel was carried out by means of immunohistochemical staining (IHC). The histological evaluation should serve as a basis for further research into the TRPC6-channel. 1.2.2 Methods Using a standardized procedure, various vessel sections were taken from a total of nine body donors from the Anatomical Institute of Saarland University and immersion-fixed in formaldehyde. The specimens were then embedded in paraffin and cut into seven micrometer thin samples using a microtome. The specimens were first stained with hematoxylin-eosin (HE) and assessed for intact morphology of the vessels, as a basic requirement for IHC. In this, the samples were incubated with a knockout-validated antibody against TRPC6 antigen structures in a concentration of 1: 100. The specificity and quality of the antibody was checked again using peptide-blocked control samples. Horseredish peroxidase (HRP) conjugated goat anti-rabbit antibodies (GOT) in a concentration of 1: 500 were used as secondary antibodies. The dilutions were made with normal goat serum (NGS). The added chromogen 3,3'-diaminobenzidine (DAB) became objectifiable through a brown coloration through a chromogen conversion catalyzed by the HRP. The samples were evaluated using a light microscope. As additional evidence of the TRPC6-protein, a Western blot was carried out on skeletonized vessel samples. In order to investigate a possible connection between COVID-19 associated vascular pathologies and the TRCP6 channel, samples from five patients who had died of COVID-19 were included in this work. 1.2.3 Results and interpretation The systematic evaluation of positive and specific protein detection of the TRPC6-channel by means of IHC shows differences in its expression in the layers of the vessel wall as well as in different vessel sections. The subendothelial stratum in the tunica intima shows clearly localizable and clear protein detection of the TRPC6-channel in only a few of the vascular sections examined. Here reproducible patterns of positive signals could be shown in several samples from the left and right renal artery as well as the aorta. The endothelial cells themselves also show evidence of the TRPC6-channel in some preparations. The tunica media is negative in almost all experiments, which suggests that the TRPC6-channel is not expressed on cells in this layer. An exception to this are the COVID-19 samples, which are the only brown herd in the tunica media. This could indicate that the TRCP6-channel is involved in COVID-19 associated vascular pathologies. The adventitia showed no clear staining pattern in a comparison between different vessel sections. Only individual structures in the adventitia, such as the vasa vasorum, were positive and reproducible with regard to the immunohistochemical protein detection of TRPC6-channels. These results suggest a vasoactivity of the TRPC6-channel in the examined vessel sections. In line with current studies, the TRPC6 could thus be involved in processes of nitric oxide (NO) mediated vasodilation, but also proliferation and fibrosis in vascular walls, such as in idiopathic pulmonary arterial hypertension (IPAH). Contrary to the current majority of research opinions, no protein detection of the TRPC6-channel using IHC in the tunica media in human vessels could be carried out. These results suggest that the TRCP6-channel has no influence whatsoever on vasoactive effects mediated by the smooth vascular muscle cells in the tunica media. Studies on this topic relate almost exclusively to animal models or cell cultures, which underlines the value of protein detection in human vessels. 1.2.4 Outlook Understanding the pathogenesis of cardiovascular disease is of immense importance due to the high prevalence and mortality of those affected. The possibilities of pharmacological modulation of the TRPC6-channel, which are already known today, could open up important new therapeutic options for certain patient groups in the future. However, further exploration of the TRPC6-channel is essential to identify its tasks and role in pathophysiological processes in human vessels