Toxicidade de nanomateriais em peixes utilizando métodos in vivo e in vitro

Orientadora: Profª Drª Marta Margarete CestariCoorientadora: Profª Drª Daniela Morais LemeTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2017Inclui referências: f.67-76Resumo: A nanotecnologia tem importante interesse social, devido sua ampla aplicação em diferentes produtos industriais. A atual preocupação com nanomateriais (NMs) é o perigo para a saúde humana e para o ambiente. Considerando que os NMs podem chegar a corpos d'água, há necessidade de estudar os efeitos tóxicos dos NMs em organismos aquáticos. Neste contexto, métodos in vivo utilizando peixes podem fornecer informações sistêmicas sobre efeitos de NMs no organismo e por meio de métodos in vitro, utilizando linhagens de células de peixes, é possível corroborar os efeitos observados nos métodos in vivo, sendo relevante em estudos ecotoxicológicos, uma vez que é possível ter tanto uma abordagem dos efeitos em um animal inteiro quanto aos modos de ação de NMs em moléculas específicas, como o DNA. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram: 1) avaliar os efeitos de nanoesferas de prata (AgNS) na espécie de peixe Hoplias intermedius, contaminada a curto e a longo prazo por exposição via trófica e comparar estes com os efeitos causados por íons de prata (Ag+) - material não particulado e de mesma composição química -, por meio de biomarcadores morfológicos (retina), genéticos (sangue, cérebro, fígado e rim) e bioquímicos (fígado); 2) avaliar o modo de ação da nano-titânio (TiO2NP), da nano-prata sem estabilizante (AgNP) e da nanoesfera de prata com estabilizante polivinilpirrolidona (AgNS) no DNA, por meio de método in vitro com a linhagem de células de peixe RTG-2. Na retina, na esclera e no nervo óptico de H. intermedius foram observadas deposições de AgNS após 40 dias de exposição, além de danos como: alterações morfológicas em bastonetes, melanossomos aderidos a cones, hemorragia e ruptura do epitélio pigmentado. A citotoxicidade foi observada pela alteração da atividade das enzimas antioxidantes (superóxido-dismutase, catalase e glutationa S-transferase) no fígado após exposição aguda, assim como alteração na concentração de hidroperóxidos lipídicos e de metalotioneínas, indicando estresse oxidativo. As AgNS foram genotóxicas em todos os tecidos de H. intermedius, tanto na exposição aguda quanto na subcrônica, em que foi observada diminuição do escore do ensaio Cometa alcalino padrão dos tratamentos em relação ao controle negativo, sugerindo o dano no DNA do tipo crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína. O fígado foi o principal tecido alvo na exposição aguda, apresentando maiores efeitos genotóxicos nos tratamentos com AgNS e Ag+, em comparação com os outros tecidos; e na exposição subcrônica, os efeitos genotóxicos por AgNS foram maiores no rim e no cérebro, enquanto que o Ag+ causou danos principalmente no fígado e no rim. Com o método in vitro e modificações em etapas do ensaio Cometa alcalino foi possível dois modos de ação de TiO2NP, AgNP a AgNS no DNA: o dano oxidativo e o crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína. Assim, confirmando o dano crosslink DNA-DNA ou DNA-proteína encontrado no DNA dos tecidos da H. intermedius. Portanto, o presente trabalho confirmou o potencial tóxico dos NMs estudados, além de demonstrar que o uso de peixes em métodos in vivo e in vitro, conjuntamente, pode avaliar de forma mais precisa os efeitos causados por NMs, predizendo o perigo para o ambiente aquático. Palavras-chave: contaminantes emergentes; nanoecotoxicologia; titânio; prata; retina; estresse oxidativo; genotoxicidade.Abstract: Nanotechnologies are at the center of societal interest, due to their broad spectrum of application in different industrial products. The current concern about nanomaterials (NMs) is the hazard to the human health and the environment. Considering that NMs can reach bodies of water, there is a need for studying the toxic effects of NMs on aquatic organisms. Within this context, the use of in vivo method with fish as model can provide systemic information of the NMs effects, and the in vitro method based on fish cell lines can be able to corroborate the effects in the in vivo methods found. In addition, the in vivo and in vitro methods together are important to the ecotoxicology, due to the possibility of a higher spectrum of results with the use of both whole animal and individual cells in the assessment toxic of NMs. For this reason, the goals were: 1) evaluate the effects of silver nanospheres (AgNS) in Hoplias intermedius fish after acute and subchronic trophic exposition and compare with the silver ion (Ag+) - not particle material with same chemical composition -, through of morphology (retina), genetic (blood, brain, liver and kidney) and biochemical (liver) biomarkers; 2) confirm the mode of action of nanoparticle of titanium dioxide (NPTiO2), silver nanoparticle no functionalized (AgNP) and silver nanosphere polyvinylpirrolidone functionalized (AgNS) in the DNA through in vitro method with RTG-2 fish cells line. AgNS deposits in retina, sclera and optic nerve region were found after exposition for 40 days. In addition, damage were observed, such as: morphologic changes in rods, melanosomes aderhered on cones, hemorrhage and deterioration of the pigment epithelium. Cytotoxic effects, such as oxidative stress, were observed through activity alteration in antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase and glutathione S-tranferase) in the liver after acute exposition, besides the lipid hydroperoxide and metalothioneins concentration were changed. AgNS were genotoxic in all H. intermedius' tissues, both acute and subchronic exposition. The alkaline Comet assay scores of the treatments were smaller than negative control, suggesting crosslink DNA-DNA or DNA-protein damage type. In addition, the liver was the main target tissue in the acute exposition with higher genotoxic effects in both AgNS and Ag+ treatments, in relation to the other tissues. In the subchronic exposition, AgNS caused higher genotoxic effects in kidney and brain, whereas the Ag+ caused effect specific tissue in liver and kidney. In order to investigate de mode of action of NMs, in vitro method with modifications in the alkaline Comet assay was performed, and two modes of actions were found, such as: oxidative DNA damage and crosslink DNA-DNA or DNA-protein. Thus, the crosslink DNA damage type found in H. intermedius could be confirmed. In conclusion, the present work confirmed the toxicity of NMs studied with in vivo and in vitro methods together that herein demonstrated an accurately evaluation of the NMs effects, with the possibility to predict the hazard of them to the aquatic environment. Keywords: emerging contaminants; nanoecotoxicology; titanium; silver; retina; oxidative stress; DNA damage